頓文亮，喻 斌，俞 云

(1.南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210029)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是慢性肝損傷向肝硬化進(jìn)展過程中的一個關(guān)鍵階段，其主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟的過度沉積，纖維結(jié)締組織增生。導(dǎo)致血液循環(huán)障礙，影響血液與肝細(xì)胞的物質(zhì)交換，加重肝細(xì)胞損傷[1]?？垢卫w膠囊具有活血通絡(luò),化瘀散結(jié)功效，臨床主要治療肝纖維化和痰瘀互結(jié)證。本實驗主要觀察抗肝纖膠囊是否具有改善肝纖維化所致慢性血瘀癥血流動力學(xué)及凝血功能異常的作用。

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量(200～240)g，周齡9～10周，由浙江大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(浙)2008-0033。

1.2 藥品與試劑 抗肝纖膠囊由三七、老鶴草、五味子等5味中藥組成,采用傳統(tǒng)水煎提取，濃縮至1.4 g(含生藥量)/mL，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，臨用前加蒸餾水配制所需濃度；CCL4(分析純)，北京化工廠；鹽酸腎上腺素注射液1 mL∶1 mg，批號20081210,天津金耀氨基酸有限公司；血漿凝血酶原時間(PT)試劑盒，批號(Lot):STG10101-32，北京世帝科學(xué)儀器公司；活化部分凝血活酶時間(APTT)測定試劑盒，批號(Lot):STG20201-24，北京世帝科學(xué)儀器公司；纖維蛋白原(FIB)測定試劑盒,批號(Lot):STG20401-22，北京世帝科學(xué)儀器公司。

1.3 實驗儀器 LDZ5-2低速自動平衡離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；LG-PABER型血小板聚集及凝血因子分析儀，北京世帝科學(xué)儀器公司;LG-R-80系列血液黏度儀，北京世帝科學(xué)儀器公司。

2 方法

2.1 實驗環(huán)境 清潔級大鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心，室溫(20±2)℃，濕度50%～60%,每天光照10～12 h。

2.2 分組與給藥 隨機(jī)將雄性大鼠分為5組，每組12只，即空白對照組(全價顆粒飼料喂養(yǎng)、自由飲水)，其他各組模型組、抗肝纖低劑量組1.5 g生藥/kg，抗肝纖中劑量組3.0 g生藥/kg,抗肝纖高劑量6.0 g生藥/kg(每日79.5%單純玉米面加20%豬油、0.5%膽固醇混合飼料飼喂大鼠，另以15%乙醇為飲料飼養(yǎng)動物)，抗肝纖各劑量組大鼠給藥容積10 mL/kg，空白對照組和模型組給等體積生理鹽水。

2.3 造模方法 40% CCL4橄欖油液，皮下注射,首劑0.5 mL/kg,以后0.25 mL/kg,每周2次，持續(xù)8周，每日79.5%單純玉米面加20%豬油、0.5%膽固醇混合飼料飼喂大鼠，另以15%乙醇為飲料飼養(yǎng)動物。第7周開始，皮下注射腎上腺素0.1 mg/(kg·d),每天分2次注射，間隔12 h，連續(xù)7 d，造成肝纖化的慢性血瘀癥模型。

2.4 實驗步驟 大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察3 d，于第4天開始抗肝纖各劑量組、模型組開始造模，并灌胃給予相應(yīng)藥物、模型組給予等體積蒸餾水，共持續(xù)8周;空白對照組給予等量蒸餾水，全價顆粒飼料喂養(yǎng)。與第7周開始，皮下注射腎上腺素0.1 mg/(kg·d),每天分2次注射，間隔12 h，連續(xù)7 d。于最后1次皮下注射腎上腺素后，各組大鼠禁食12 h,于次日用10%水合氯醛麻醉(300 mg/kg腹腔注射)，仰位固定，頸動脈插管放血，分別用3.8%的枸櫞酸鈉溶液和肝素鈉生理鹽水溶液(500 U/mL)按1∶9抗凝。

2.5 實驗檢測指標(biāo) 1)全血黏度:將肝素鈉抗凝的血液采用LG-R-80系列血液黏度儀測定。2)血漿黏度：全血測試完畢后，剩余血樣以3 000 r/min離心,進(jìn)行血漿黏度的測試。3)凝血功能：將3.8%的枸櫞酸鈉抗凝的血液以3 000 r/min離心10 min，分離血小板血漿，采用LG-PABER型血小板聚集及凝血因子分析儀于37 ℃測定血小板最大聚集率、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、血漿纖維蛋白原(FIB)。

3 結(jié)果

3.1 抗肝纖膠囊對慢性血瘀大鼠全血黏度和血漿黏度的影響 見表1。

3.2 抗肝纖膠囊對慢性血瘀大鼠血小板聚集和凝血功能的影響 見表2。

表1 抗肝纖膠囊對慢性血瘀癥模型大鼠血流動力學(xué)的影響(±s,n=8)

表2 抗肝纖膠囊對慢性血瘀癥模型大鼠血小板聚集和凝血參數(shù)的影響(±s,n=8)

4 討論

肝纖維化屬中醫(yī)“脅痛”“黃疸”“積聚”等范疇，主要病機(jī)為血瘀阻絡(luò)、正氣虛損和濕熱內(nèi)蘊(yùn)。血瘀是肝纖維化形成的基本病機(jī)，也是各種肝病最根本、最重要的病理改變[2]。本實驗參考四氯化碳、高脂、乙醇等復(fù)合因素造成大鼠肝纖維化模型和腎上腺素復(fù)制大鼠血瘀癥模型文獻(xiàn)[3-7]，并結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，獨創(chuàng)地復(fù)制出大鼠肝纖維化的慢性血瘀癥模型，較以往用腎上腺素造成的血瘀模型更符合肝纖維化所表現(xiàn)的血液高凝狀態(tài)；比四氯化碳等造成肝纖化的血瘀模型更穩(wěn)定。以往的研究[6]發(fā)現(xiàn)，肝血瘀阻與肝纖維化密切相關(guān)，并與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。肝組織內(nèi)纖維結(jié)締組織增生導(dǎo)致：小葉中心的纖維化阻礙血流進(jìn)入肝靜脈，使肝功能損害及循環(huán)障礙；纖維隔的血管交通支使進(jìn)出肝臟的血供相交通,導(dǎo)致門脈高壓和微循環(huán)紊亂[9];T細(xì)胞、枯否細(xì)胞等炎性細(xì)胞激活，釋放相關(guān)細(xì)胞因子，引起機(jī)體凝血-纖溶系統(tǒng)異常和血小板功能紊亂[10]；以及通過眾多環(huán)節(jié)引起的血液循環(huán)障礙。前期實驗證實了抗肝纖膠囊能顯著改善四氯化碳所致的肝功能異常；本實驗顯示了抗肝纖膠囊顯著改善肝纖維化的慢性血瘀癥的血流動力學(xué)和凝血功能異常。中藥復(fù)方抗肝纖膠囊可通過多層次、多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)干預(yù)、調(diào)節(jié)肝纖維化進(jìn)程，具有獨特的優(yōu)勢。

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