楊叔禹，趙能江，孫素云，李燦東

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350108；2.廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 廈門(mén) 361003；3.廈門(mén)市糖尿病研究所，福建 廈門(mén) 361003)

隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)和生活方式發(fā)生改變，導(dǎo)致肥胖、糖尿病、高血脂、高血壓等系列代謝紊亂的發(fā)生率越來(lái)越高，而這些疾病的聚集出現(xiàn)被稱為代謝綜合征(metabolic syndrome)，是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。深入研究代謝綜合征的發(fā)病機(jī)制，離不開(kāi)能反映其病機(jī)特點(diǎn)的理想動(dòng)物模型，而高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠模型應(yīng)用廣泛，能較好地模擬人類飲食結(jié)構(gòu)改變?cè)斐傻姆逝帧⒏哐燃膊?，因此其可能是較理想的模擬人類代謝綜合征的動(dòng)物模型之一[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠,從糖脂代謝的角度對(duì)模型進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)SD大鼠20只，體質(zhì)量為(150±20)g，購(gòu)于廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(滬):2007-0005。大鼠飼養(yǎng)由廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，室內(nèi)溫度和濕度分別保持在22 ℃和50%,明暗周期為12 h，自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠分為普食組(Normal)和高脂組(HFD,含20%豬油)各10只，每周監(jiān)測(cè)進(jìn)食量和體質(zhì)量。

1.2 試劑和儀器 普通胰島素購(gòu)自諾和諾德公司，穩(wěn)豪One Touch血糖儀及血糖試紙購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司，普通飼料購(gòu)自廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，高脂飼料購(gòu)自蘇州雙獅公司。

1.3 糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(ITT) 高脂飼養(yǎng)8周后,對(duì)大鼠進(jìn)行OGTT和ITT試驗(yàn)。OGTT方法：大鼠禁食12 h，稱重后給予葡萄糖灌胃，劑量 2 g/kg，在灌胃后0、30、60、90、120、180 min 分別尾靜脈采血，血糖儀檢測(cè)血糖。ITT方法：在OGTT結(jié)束3 d之后,大鼠禁食4 h，稱重后腹腔注射胰島素，劑量0.75 U/kg，在注射后0、15、30、60、90、120 min 分別尾靜脈采血，血糖儀檢測(cè)血糖。

1.4 標(biāo)本采集 OGTT和ITT結(jié)束后，大鼠處死前1 d晚上禁食禁水，第2天上午稱重后，經(jīng)心臟取血后處死大鼠，離心后得到血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功、血脂、血糖等生化指標(biāo)。迅速取出大鼠的肝臟和內(nèi)臟脂肪(附睪、腎周脂肪)，稱重后，部分用4%甲醛固定備免疫組化，剩余部分放入液氮凍存。

1.5 組織病理染色 將固定好的組織用梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，縱向切片(約4 μm厚度)，蘇木精和伊紅染色(HE)染色，光鏡下觀察形態(tài)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài) 普食組大鼠狀態(tài)良好，動(dòng)作自如，反應(yīng)靈敏，毛皮有光澤。高脂組大鼠體型肥胖，動(dòng)作遲緩不喜動(dòng)，反應(yīng)欠靈活，毛皮無(wú)光澤。2組飲食攝入無(wú)明顯差異。

2.2 2組大鼠體質(zhì)量和內(nèi)臟重量比較 見(jiàn)表1。

表1 2組肝臟和脂肪重量比較(±s，n=10)

2.3 2組血清學(xué)指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。

表2 2組血清生化指標(biāo)比較(±s，n=10)

2.4 2組OGTT和ITT變化 見(jiàn)圖1。葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT)可反映機(jī)體對(duì)葡萄糖和胰島素的耐性受。圖1顯示，給大鼠葡萄糖灌胃后，血糖明顯升高,在60 min時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，然后逐步下降，但高脂組血糖在60、90和120 min時(shí)間點(diǎn)均明顯高于正常組(P<0.05)。在ITT中也出現(xiàn)類似結(jié)果，高脂組在15、90和120 min的血糖明顯高于普食組(P<0.05)。

圖1 OGTT和ITT變化情況

2.5 2組組織病理變化 見(jiàn)圖2。圖中a和b顯示脂肪組織HE染色情況,高脂組脂肪細(xì)胞體積膨大;c和d為肝組織切片，高脂組大鼠肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不等的脂滴空泡，為典型的脂肪肝表現(xiàn)。參照NASH的組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2],根據(jù)顯微鏡下脂肪數(shù)量，將肝細(xì)胞脂肪變分為4個(gè)程度:0分(肝細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂滴沉積)、1分(肝小葉內(nèi)<30%的肝細(xì)胞有脂肪變)、2分(肝小葉內(nèi)30%～50%的肝細(xì)胞有脂肪變)、3分(50%～75%的肝細(xì)胞有脂肪變)、4分(75%以上的肝細(xì)胞有脂肪變)。定量分析肝臟脂肪變性程度，高脂組分?jǐn)?shù)(3.3±0.87)，明顯高于普食組的分?jǐn)?shù)(0.30±0.48)，2組比較(P<0.05)。

a和c為正常組，b和d為高脂組

3 討論

隨著人們生活水平的提高，肥胖、高血壓、糖尿病和血脂異常等疾病的患病率迅速增加，這些疾病的聚集出現(xiàn)，被稱為代謝綜合征，是公認(rèn)的心血管疾病的危險(xiǎn)因素[3]。飲食和環(huán)境因素與代謝疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，動(dòng)物給予高脂高熱量的飲食，并且在籠中飼養(yǎng)限制其活動(dòng)，在一定程度上模擬了人類能量過(guò)剩，運(yùn)動(dòng)缺乏的生活狀態(tài)，能夠引起包含肥胖、血脂紊亂、糖調(diào)節(jié)受損等代謝綜合征的疾病組分[4]。目前用來(lái)模擬人類代謝綜合征的模型很多，包括遺傳、轉(zhuǎn)基因、基因敲除、外科干預(yù)和藥物誘導(dǎo)等，但是代謝綜合征是涉及多基因的復(fù)雜疾病，很多模型往往只具備了代謝綜合征的部分特點(diǎn)；而高脂飼養(yǎng)的動(dòng)物模型具備代謝綜合征的多個(gè)組分，因而能夠較全面反映代謝綜合征的本質(zhì)。肥胖是代謝綜合征的主要表現(xiàn)之一，飲食誘導(dǎo)的肥胖動(dòng)物模型已經(jīng)廣為應(yīng)用。SD大鼠具有形體適中容易操作、脂肪組織取材方便、血量較多采血容易等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于肥胖機(jī)制和抗肥胖藥物研究[5]。我們發(fā)現(xiàn)，高脂飼養(yǎng)的肥胖大鼠主要表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪增多，脂肪細(xì)胞體積增大，符合代謝綜合征以腹型肥胖為主的特點(diǎn)。關(guān)于高脂誘導(dǎo)的時(shí)間，有研究[7]報(bào)道給予高脂飲食2周后體質(zhì)量已經(jīng)明顯增加，誘導(dǎo)4周后各種癥狀更加明顯，可出現(xiàn)血壓增高、糖耐量受損等表現(xiàn)，與我們的結(jié)果相符，限于實(shí)驗(yàn)條件，本研究未監(jiān)測(cè)大鼠血壓。

胰島素抵抗是指機(jī)體對(duì)胰島素的反應(yīng)性降低，是代謝綜合征的病理基礎(chǔ)[8]。目前建立的胰島素抵抗動(dòng)物模型大多以正常鼠類為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)特殊的膳食喂養(yǎng)(高脂或高果糖)使其發(fā)生肥胖和高胰島素血癥,從而出現(xiàn)胰島素抵抗。高脂或高果糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗，與臨床高脂、高熱量飲食所致的糖耐量異常、Ⅱ型糖尿病、肥胖等誘因相似，同時(shí)該方法造模簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、價(jià)格比遺傳模型更為低廉，是較為理想的胰島素抵抗動(dòng)物模型[4]。正常血糖-高血漿胰島素鉗夾技術(shù)是公認(rèn)的評(píng)價(jià)胰島素抵抗的金指標(biāo)，但操作復(fù)雜，影響因素較多。我們采用OGTT和ITT[9]，即給予葡萄糖和胰島素，通過(guò)尾靜脈采血檢測(cè)血糖，觀察動(dòng)物對(duì)糖和胰島素的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)高脂模型大鼠存在明顯的胰島素耐受，完全符合胰島素抵抗的主要特征。

脂肪肝是指肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過(guò)多的病變，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為，非酒精性脂肪肝是代謝綜合征的組成部分[10]。非酒精性脂肪肝與進(jìn)食過(guò)多、肥胖等密切相關(guān),約30%～50%的肥胖者合并脂肪肝,重度肥胖者脂肪肝發(fā)病率高達(dá)61%～94%[11]。通過(guò)高脂喂養(yǎng)發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟體積增大，重量增加，肝臟切片有明顯的脂肪浸潤(rùn)，出現(xiàn)大量脂滴和空泡，符合非酒精性脂肪肝的組織特點(diǎn)。脂肪肝和肝損害的出現(xiàn)與肥胖相關(guān)的三酰甘油積累呈正相關(guān)[12]，在本研究中，高脂喂養(yǎng)后的大鼠，血清TG、TC、LDL-C含量均顯著升高，內(nèi)臟脂肪重量增加，體積增大，肝臟脂肪變性，說(shuō)明高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致血脂代謝紊亂，脂肪貯存增加和脂肪肝，這可能是高脂飲食導(dǎo)致代謝綜合征的原因之一。

綜上所述，高脂飲食更接近人類的生活狀況，能較好模擬環(huán)境因素導(dǎo)致的多種代謝紊亂，如腹型肥胖、胰島素抵抗、血脂紊亂、脂肪肝等表現(xiàn)，與人類代謝綜合征相近，因此高脂誘導(dǎo)的肥胖大鼠是代謝綜合征的理想動(dòng)物模型。然而，人類的飲食結(jié)構(gòu)和種類比高脂飲食更復(fù)雜，因此高脂大鼠模型和人類的代謝綜合征的差別，也需在今后的研究中加以分析。

[1]夏燕萍,陳剛,俞茂華.高糖高脂飲食誘導(dǎo)建立SD大鼠代謝綜合征模型[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(17):2607-2609.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性脂肪肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南[J].中華肝臟病雜志，2010,18(3)163-166.

[3]Gaddam KK,Ventura HO,Lavie CJ.Metabolic syndrome and heart failure-the risk,paradox,and treatment[J].Curr Hypertens Rep,2011,13(2):142-148.

[4]Panchal SK,Brown L.Rodent models for metabolic syndrome research[J].J Biomed Biotechnol,2011,10(11):1-12.

[5]李潔,張霞.代謝綜合征研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,24(4):459-460.

[6]何勇,陳曉雯.代謝綜合征動(dòng)物誘發(fā)模型的研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,21(3):92-94.

[7]Sutherland LN,Capozzi LC,Turchinsky NJ,et al.Time course of high-fat diet-induced reductions in adipose tissue mitochondrial proteins: potential mechanisms and the relationship to glucose intolerance[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2008,295(5):1076-1083.

[8]丁少川,張瑞珍,劉成桂.胰島素抵抗的中醫(yī)藥研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,25(5):795-796.

[9]蔣英,宮賀.Ⅱ型糖尿病糖耐量實(shí)驗(yàn)與胰島素釋放實(shí)驗(yàn)關(guān)系的探討[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007,6(12):64-65.

[10]Lim JS,Mietus-Snyder M,Valente A,et al.The role of fructose in the pathogenesis of NAFLD and the metabolic syndrome[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2010,7(5):251-264.

[11]Day CP.Non-alcoholic fatty liver disease: a massive problem[J].Clin Med,2011,11(2):176-178.

[12]Trauner M,Claudel T,Fickert P,Moustafa T,Wagner M.Bile acids as regulators of hepatic lipid and glucose metabolism[J].Dig Dis,2010,28(1):220-224.