吳怡，王嵐，劉蘭，韓清

(1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病原生物學教研室，遼寧 沈陽 110034;2.解放軍95979部隊衛(wèi)生教研室)

PAK4(P21-activated kinase 4)是參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要蛋白質(zhì)。目前，很多學者相繼報道了一些與PAK4相互作用的靶蛋白，表明其在腫瘤進展中存在特有的作用方式。而酵母雙雜交是一種高通量的蛋白質(zhì)相互作用篩選方法，順序轉(zhuǎn)化法是將研究的目的蛋白相繼轉(zhuǎn)化到酵母菌中進行篩選，此方法陽性率比較高，而且結(jié)果可信度比較高。本研究旨在利用酵母雙雜交的方法，從人胎腦cDNA文庫中篩選PAK4相互作用蛋白，進一步了解其生物學特性和功能。

1 材料與方法

1.1 主要材料 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞自備。酵母菌 AH109，載體 pGBKT7，人胎腦MATCHMAKER cDNA文庫均購自Clontech公司。x-α-gal試劑，酵母YPDA培養(yǎng)基的蛋白胨，SD全氨基酸培養(yǎng)基、DO/-Trp、DO/-Leu、DO/-Trp/-Leu、 DO/-Trp/-Leu/-His、 DO/-Trp/-Leu/-His/-Ade氨基酸缺陷培養(yǎng)基分別購于Clontech公司，BBI公司，BD公司。DNA序列測定及兩對引物的合成由Invitrogen生物技術(shù)公司完成。設計的兩對引物序列見表1。

表1 擴增PAK4KD所用引物序列

1.2 實驗方法

1.2.1 PAK4KD/pGBKT7質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)pGBKT7質(zhì)粒多克隆位點和PAK4基因的酶切分析，選用了 Nde I和 BamH I作為克隆位點，再從PAK4KD基因的閱讀框架序列的兩端分別設計含Nde I和BamH I酶切位點的引物。以PAK4基因全長為模板，進行PCR擴增，反應條件為:95℃變性5 min后，94℃ 50 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)30次，最后于72℃延伸10 min。反應終止后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳后，試劑盒分別回收約800 bp PAK4KD的PCR產(chǎn)物。用Nde I和BamH I對PAK4KD PCR純化產(chǎn)物及pGBKT7分別進行酶切。純化后以T4 DNA連接酶于常溫連接2 h，4℃過夜。大腸桿菌轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后，37℃培養(yǎng)過夜擴增，制備質(zhì)粒DNA。用堿裂解法提取質(zhì)粒進行酶切鑒定并測序。

1.2.2 Western blot證實酵母蛋白表達 將轉(zhuǎn)染的AH109酵母菌30℃過夜培養(yǎng)，次日擴增4 h(OD600達 0.4～0.6)，菌液中加入 Complete Cracking buffer、玻璃珠提取酵母蛋白。將其經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecylsulfonate-polyacrylate gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，40 V電壓轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride membrane，PVDF)膜上，4℃過夜，用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜3 h，TBST(Tris Buffered Saline with Tween 20)清洗3次 (15 min/次)。將此膜加入抗 C-myc抗體(1∶500)室溫3 h，TBST清洗2次 (15 min/次);辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000)，室溫下輕搖2 h，電化學發(fā)光 (electrochemiluminescence，ECL)顯色，壓片。

1.2.3 順序轉(zhuǎn)化法篩選胎腦文庫相互作用陽性克隆 將已轉(zhuǎn)入PAK4KD的AH109酵母菌30℃過夜培養(yǎng) (OD600＞1.5)，次日擴增3 h［OD600達到 (0.5±0.1)］。按照Clontech說明書上提供的小劑量PEG/LiAc酵母轉(zhuǎn)化的方法，將胎腦文庫順轉(zhuǎn)到已轉(zhuǎn)入pGBKT7-PAK4KD的AH109菌種中。將轉(zhuǎn)化后的AH109酵母菌涂于SD/-Trp/-Leu+3-AT(25mM)平板上，30℃倒置培養(yǎng)3～4 d。用SD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基將SD/-Trp/-Leu板培養(yǎng)基上生長的菌落沖下來，然后稀釋1 000倍，涂于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上，30℃倒置培養(yǎng)6～8 d。挑取生長良好的菌落接種于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/x-α-gal平板上，2～3 d后，篩選藍色陽性菌落。

1.2.4 陽性克隆的序列分析 將陽性單克隆酵母菌落提取質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，37℃培養(yǎng)過夜擴增，堿變性法提取細菌質(zhì)粒DNA分別用BglⅡ和HaeⅢ酶切鑒定、測序。陽性克隆AD-Y質(zhì)粒從兩端測序，所得的序列與NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫作BLAST比較分析。

2 結(jié)果

2.1 PAK4KD/pGBKT7重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 PAK4KD是將PAK4的325～579氨基酸構(gòu)建到pGBKT7的載體中。將PAK4KD/pGBKT7重組質(zhì)粒用Nde I和BamH I雙酶切后，得到約762 bp及7 300 bp左右的兩條帶，與預期結(jié)果相符 (圖1)，并經(jīng)測序鑒定正確。

圖1 重組質(zhì)粒pGBKT7-PAK4KD酶切鑒定結(jié)果M:Lambda DNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker;1:Nde I/BamHⅠ消化pGBKT7-PAK4KD

2.2 Western blot證實酵母蛋白表達結(jié)果 提取轉(zhuǎn)化了pGBKT7空載體和pGBKT7-PAK4KD質(zhì)粒的AH109酵母總蛋白，進行Western blot檢測。1提取AH109酵母蛋白，為陰性對照;2提取轉(zhuǎn)化了pGBKT7空載體的AH109酵母蛋白，載體在酵母中表達myc蛋白，為陽性對照;3提取轉(zhuǎn)化pGBKT7-PAK4KD質(zhì)粒的AH109酵母蛋白，用抗C-myc抗體進行Western blot鑒定PAK4KD-myc蛋白，證實了融合蛋白的表達 (52 KD)，結(jié)果見圖2。

圖2 誘餌蛋白在酵母中的表達1:陰性對照;2:陽性對照;3:PAK4KD-myc融合蛋白

2.3 順序轉(zhuǎn)化法篩選胎腦文庫的相互作用的陽性克隆 以PAK4KD為誘餌蛋白，從人胎腦文庫篩選PAK4相互作用蛋白，以下是在SD缺陷的平板上生長的情況。見圖3。

圖3 順序轉(zhuǎn)染法從文庫篩選PAK4KD相互作用蛋白結(jié)果注:在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/x-α-gal生長變藍的菌為His+和LacZ+陽性轉(zhuǎn)化子

2.4 陽性克隆的鑒定 挑取His+和LacZ+陽性酵母轉(zhuǎn)化子，提取酵母質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入大腸桿菌，堿裂解法提取質(zhì)粒，BglⅡ酶切鑒定文庫插入片斷大小(圖4)。圖中所示8 000 bp附近的條帶為文庫載體pGADT7位置，在該載體多克隆位點的兩端各有一個BglⅡ酶切位點，人胎腦文庫就構(gòu)建在這個酶切位點中。陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒用BglⅡ進行酶切，切出不同大小片斷外源插入的文庫基因。

圖4 Bg1Ⅱ酶切鑒定不同克隆M1:lambda EcoRⅠ+HindⅢMarker;M2:DL 2000;1～9:BglⅡ酶切鑒定陽性克隆

3 討論

PAK(P21-activated kinase)家族磷酸化下游底物絲氨酸/蘇氨酸殘基，參與許多重要生物學活性調(diào)節(jié)，如細胞骨架的調(diào)節(jié)、細胞凋亡、細胞周期、血管生成及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等，特別是在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移中，PAK有著重要的生物學作用。

PAK4是Ⅱ類PAKs中發(fā)現(xiàn)最早，也是目前研究比較多的Ⅱ類 PAK［1］。PAK4結(jié)合并磷酸化slingshot，使slingshot/LIMK1復合體中的LIMK1去磷酸化，刺激肌動蛋白骨架重組［2］;磷酸化Rho家族鳥嘌呤核苷交換因子GEF-H1的Ser810位點阻斷GEF-H1依賴的應力纖維生成，促進細胞片狀偽足的形成［3］;PAK4的C-末端激酶區(qū)與整合蛋白αvβ5相互作用調(diào)節(jié)細胞遷移和腫瘤細胞的分化［4］。PAK4可激活 JNK，p38 MAPK 通路，而MAP kinase kinase 6(p38 MAPK上游的激活子)可激活 PAK4，參與細胞對應激信號的反應［5］。PAK4的C-末端與 PRG(PDZ RhoGEF)C-末端相互作用，抑制Rho家族小鳥苷三磷酸酶 (Rho GTPase)的活性。另外，肝細胞生長因子 (human growth factor，HGF)與腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，可活化上皮細胞PAK4并導致細胞應力纖維和粘著斑減少，細胞變圓，增加細胞的移動［6］。

根據(jù) PAK4的結(jié)構(gòu)特點，將 PAK4激酶域(PAK4KD)構(gòu)建到 pGBKT7(含 TRP1基因、GAL4 DNA結(jié)合區(qū))質(zhì)粒中。利用順序轉(zhuǎn)化法從構(gòu)建到pACT2質(zhì)粒 (含LEU2基因和GAL4激活區(qū))的人胎腦文庫中篩選相互作用的蛋白質(zhì)。經(jīng)過氨基酸缺陷培養(yǎng)基的多次篩選，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒酶切驗證后測序，得到了多個與PAK4相互作用蛋白質(zhì)的序列，NCBI對測序結(jié)果分析它們與癌癥轉(zhuǎn)移、細胞胞吐過程、蛋白質(zhì)泛素化等相關(guān)。這一結(jié)果為進一步研究PAK4的生物學功能提供了新的思路。

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