龔洪濤，馬先林，杜鳳和

原發(fā)性高血壓可引起多種并發(fā)癥，其發(fā)病是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。腎素 －血管緊張素 －醛固酮系統(tǒng)(RAAS)是體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓和水、電解質(zhì)平衡的主要系統(tǒng)，在高血壓的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，RAS基因與高血壓密切相關(guān)［1］。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (angiotensin conversion enzyme，ACE)是血管緊張素Ⅰ (angiotensinⅠ，AngⅠ)轉(zhuǎn)換為血管緊張素Ⅱ (angiotensinⅡ，AngⅡ)和緩激肽滅活的關(guān)鍵酶;醛固酮合成酶 (CYP11B2)是醛固酮合成的關(guān)鍵酶，是一種線粒體的細(xì)胞色素P450氧化酶。對(duì)于RAAS基因多態(tài)性的研究已成為近年來(lái)的熱點(diǎn)之一［2－4］，本研究以原發(fā)性高血壓病 (EH)患者為研究對(duì)象，探討ACE I/D和CYP11B2－344C/T多態(tài)性與EH的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) 選取2005年6月—2007年1月于我院就診的漢族高血壓患者200例為高血壓組，其中男90例，女110例，年齡35～77歲，平均 (53.7±10.6)歲。均符合1999年世界衛(wèi)生組織/國(guó)際高血壓協(xié)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)，收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和 (或)舒張壓≥90 mm Hg;調(diào)查前2周內(nèi)服用降壓藥者及既往曾被診斷為高血壓者也被納入高血壓組。排除繼發(fā)性高血壓，嚴(yán)重心功能不全，嚴(yán)重肝、腎功能障礙，3個(gè)月內(nèi)有心肌梗死及腦卒中者，妊娠或哺乳婦女。選擇我院同期就診的正常血壓者192例作為對(duì)照組，其中男98例，女94例，年齡 (51.6±8.1)歲，均為漢族。收縮壓＜140 mm Hg，且舒張壓＜90 mm Hg，無(wú)服用降壓藥史，無(wú)高血壓家族史，對(duì)照人群的排除標(biāo)準(zhǔn)與病例排除標(biāo)準(zhǔn)相同。

1.2 人體基本參數(shù)測(cè)定 測(cè)定身高、體質(zhì)量、血壓等，血壓測(cè)量時(shí)靜坐10 min，使用標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式血壓計(jì)于坐位連續(xù)測(cè)量3次，每次間隔10 min取其均值。以體質(zhì)量/身高2計(jì)算體質(zhì)指數(shù) (bodymass index，BMI)。

1.3 生物化學(xué)指標(biāo)測(cè)定 抽取空腹靜脈血，離心取血清，采用生化分析儀檢測(cè)空腹血糖、三酰甘油 (triglyceride，TG)、總膽固醇 (total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL－C)及高密度脂蛋白膽固醇 (HDL－C)等指標(biāo)。

1.4 DNA提取 取冷凍EDTA抗凝全血，水浴解凍，E.Z.N.ATM Blood DNA Kit(OMEGA)試劑盒提取DNA，－20℃保存。

1.5 聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)擴(kuò)增及限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(PFLP)ACE I/D PCR引物:上游引物序列:5'－CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT－3'，下游引物序列:5'－GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT－3'。CYP11B2－344C/T PCR引物:上游引物序列:5'－ATGTTGACCACAGGAGGAGAC－3'，下游引物序列:5'－CCAGGGCTGAGAGGAGTAAAATG－3'，反應(yīng)體系為10μl，包括20 ng基因組DNA 2.0μl，PCR引物 (5 pmol/L)各0.6μl，2×Taq PCR Master Mix 5μl，用滅菌蒸餾水補(bǔ)充至10μl。PCR反應(yīng)參數(shù):首先95℃變性10 min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每1個(gè)循環(huán)包括94℃變性30 s，分別在58℃和62℃退火30 s，72℃延伸40 s。最后，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像儀成像。

取CYP11B2－344C/T PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl，5 U HaeⅢ內(nèi)切酶 (美國(guó)promega公司生產(chǎn))，10 ENB緩沖液2μl，加雙蒸水補(bǔ)足體積為20μl，37℃溫育12 h后，取10μl上述產(chǎn)物，用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠在電壓100 V，1×TAE緩沖液中電泳45 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并保存酶切結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SSPS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)量資料采用(±s)表示，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示。遺傳平衡檢驗(yàn)采用哈代－溫伯格 (Hardy－Weinberg)平衡定律。兩組間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn);與高血壓相關(guān)的影響因素分析采用多元Logistic回歸;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高血壓組和對(duì)照組一般臨床資料比較 兩組患者的空腹血糖、TG、HDL－C和LDL－C水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);兩組BMI和TC水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，見(jiàn)表1)。

2.2 ACE I/D多態(tài)性與高血壓的關(guān)系

2.2.1 基因型頻率和等位基因頻率分布比較 I等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物為490 bp，D等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物為190 bp，共得到II、ID和DD 3種基因型。高血壓組和對(duì)照組Ⅱ、ID和DD基因型頻率分布均符合Hardy－Weinberg平衡 (P＞0.05)，說(shuō)明達(dá)到了遺傳平衡，具有群體代表性。兩組基因型和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見(jiàn)表2)。

2.2.2 多元Logistic回歸分析 本研究用高血壓為因變量，以年齡、BMI、空腹血糖、TG、TC等心血管病危險(xiǎn)因素及基因型作為自變量，進(jìn)一步采用多元Logistic回歸模型分析了ACE I/D基因多態(tài)與高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)是否獨(dú)立于其他傳統(tǒng)的心血管病危險(xiǎn)因素 (見(jiàn)表3)。校正了傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的影響后，ACE DD基因型的攜帶者患高血壓的危險(xiǎn)性顯著增加 (P=0.003)，OR值為3.66〔95%CI(1.54，8.69)〕。

表1 高血壓組和對(duì)照組臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data between EH group and control group

表2 高血壓組和對(duì)照組ACE I/D基因型和等位基因頻率分布〔例(頻率)〕Table 2 Freqencies of ACE I/D genotypes and allele between EH and control group

表3 Logistic回歸分析ACE I/D多態(tài)性與EH的相關(guān)性Table 3 Logistic regression analyze the association of ACE I/D polymorphism and EH

2.3 CYP11B2－344C/T多態(tài)性與高血壓的關(guān)系

2.3.1 CYP11B2－344C/T多態(tài)性 CYP11B2－344C/T位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為273 bp片段，若擴(kuò)增片段中存在C－344T堿基替換，則產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶HaeⅢ位點(diǎn) (GG/CC)，TT基因型的擴(kuò)增片段不存在HaeⅢ酶切位點(diǎn)，出現(xiàn)一個(gè)273 bp片段;CC基因型存在HaeⅢ酶切位點(diǎn)，將出現(xiàn)214 bp和59 bp兩個(gè)片段;TC基因型則產(chǎn)生273 bp、214 bp和59 bp 3個(gè)片段。

2.3.2 基因型頻率和等位基因頻率分布比較 CYP11B2－344C/T的基因型頻率在高血壓組和對(duì)照組的分布均符合Hardy－Weinberg平衡 (P＞0.05)，說(shuō)明達(dá)到了遺傳平衡，具有群體代表性。高血壓組基因型與等位基因頻率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見(jiàn)表4)。

表4 高血壓組和對(duì)照組CYP11B2－344C/T基因型和等位基因頻率分布〔例 (頻率)〕Table 4 Freqencies of CYP11B2－344C/T genotypes and allele between EH and control group

3 討論

ACE基因I/D多態(tài)性存在于自然人群中，其等位基因及各基因型的分布有明顯的種族和地區(qū)差異，白種人ACE基因的D等位基因頻率為0.562，黑人為0.603，亞洲人為0.39［5］。本研究中，正常對(duì)照組192例漢族人D等位基因頻率為0.37，與報(bào)道較為接近。近年來(lái)關(guān)于ACE基因I/D多態(tài)性與EH的關(guān)系的研究報(bào)道不盡相同。一項(xiàng)對(duì)684名志愿者進(jìn)行6年的隊(duì)列研究，其中DD基因型225例，高血壓42例，高血壓患病率為18.3%;ID基因型335例，高血壓16例，高血壓患病率為4.7%;Ⅱ基因型124例，高血壓2例，高血壓患病率為1.6%，表明ACE基因DD基因型與高血壓的發(fā)生相關(guān)［6］。Barbalic等［7］通過(guò)多元 Logistic回歸分析，引入模型的危險(xiǎn)因素有性別、年齡、肥胖指數(shù)、TG、TC，最后發(fā)現(xiàn)DD基因型攜帶者發(fā)生高血壓病的危險(xiǎn)是Ⅱ基因型攜帶者的2.5倍〔95%CI(1.19，5.25)，P=0.02〕。而 Jeunemaitre 等［8］和Harrap等［9］研究認(rèn)為ACE基因與高血壓無(wú)關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，ACE基因I/D各基因型在EH患者和正常人群之間有顯著差異，高血壓組和對(duì)照組DD基因型頻率分別為0.28和0.12，前者明顯高于后者。用多元Logistic回歸模型校正了傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的影響后，ACE基因DD基因型的攜帶者患高血壓的危險(xiǎn)性顯著增加，OR值為3.66〔95%CI(1.54，8.69)〕，進(jìn)一步證實(shí)了DD基因型與EH的相關(guān)性。ACE基因I/D多態(tài)性顯著影響了血漿和細(xì)胞的ACE水平，DD型最高，ID型次之，Ⅱ型最低，因而推測(cè)等位基因D在ACE基因表達(dá)調(diào)控中起活化作用，而等位基因I起抑制作用。因而DD純合子血漿中ACE水平較高，導(dǎo)致血液循環(huán)和器官組織內(nèi)AngI轉(zhuǎn)化率升高，AngⅡ生成增多，影響機(jī)體內(nèi)水鈉代謝平衡、醛固酮的分泌、血管收縮和血管平滑肌增殖。這均是導(dǎo)致心血管疾病尤其是高血壓發(fā)病的關(guān)鍵因素。

CYP11B2基因與EH關(guān)系目前多限于－344C/T多態(tài)性的研究，不同種族－344C/T多態(tài)性分布不同，日本正常人群T和C等位基因頻率分別為0.68和0.32［10］，高加索白人正常人群T和C等位基因頻率分別為0.53和0.47［11］。本研究中，漢族正常人群T和C等位基因頻率分別為0.74和0.26，與日本人接近。Tamaki等［10］研究表明，TC+CC基因型在正常人中明顯低于高血壓患者，在EH患者中TC+CC基因型與高醛固酮血漿腎素活性比率 (ALD/PRA)明顯相關(guān)，并且在動(dòng)態(tài)血壓監(jiān)測(cè)中TC+CC基因型患者血壓明顯高于TT基因型者，因此認(rèn)為醛固酮合成酶基因T(－344)C多態(tài)性是低腎素高血壓的一個(gè)遺傳標(biāo)志。Pojoga等［12］研究表明，醛固酮合成酶基因T(－344)C多態(tài)性中C等位基因與血漿醛固酮水平明顯相關(guān)，但研究結(jié)果T(－344)C多態(tài)性與高血壓無(wú)關(guān)。Tsujita等［13］在日本人群中研究未發(fā)現(xiàn)醛固酮合成酶基因T(－344)C多態(tài)性與高血壓有相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，高血壓組基因型及等位基因頻率與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異，說(shuō)明CYP11B2基因－344T/C多態(tài)性與我國(guó)漢族人群EH發(fā)生無(wú)相關(guān)性。

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