李 晉 郭新榮 張秋紅 常艷旭

天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室天津中醫(yī)藥大學，天津 300193

獨活為傘形科植物重齒毛當歸［Ange1ica pubescens Maxim f biserrata Shan et Yuan］的根，是一種常見的中藥，具有祛風除濕，通痹止痛之功效，用于風寒濕痹，腰膝疼痛，少陰伏風頭痛，風寒協(xié)濕頭痛［1］?，F(xiàn)代研究表明，獨活含有數(shù)十種香豆素類化合物，如東莨菪內(nèi)脂、傘形花內(nèi)脂、二氫山芹醇、補骨脂素、二氫歐山芹醇乙酸酯，蛇床子素、異歐前胡素二氫歐山芹素等，其中蛇床子素含量最高［1］。

目前，獨活總香豆素含量測定方法主要以采用紫外分光光度法為主［2－3］，但該種方法由于每次僅能1－3個樣品，具有低通量的特點，不適合大量的樣品檢測。因此，本試驗以蛇床子素為對照品，用多功能讀板機，擬建立一種高通量的獨活中總香豆素含量測定方法，為獨活藥材及飲片控制提供一種簡單、快速、高通量的分析方法。

1 儀器與試藥

AX－105十萬分之一天平;BP121S萬分之一天平 (德國賽多利斯);SB－1000YDTD超聲清洗槽 (寧波新芝科技股份有限公司，40KHZ);微量多功能讀板機 (infinite M200);96孔板 (Cos96ft－Corning 96 F1at Transparent)。

蛇床子素對照品 (成都曼斯特生物科技有限公司)，甲醇 (色譜純)，無水乙醇 (分析純)，純水，不同產(chǎn)地獨活飲片購買于藥材各地藥材市場，經(jīng)作者鑒定為傘形科獨活。分別粉碎，過100目篩，密封保存，備用。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取減壓干燥至恒重的蛇床子素對照品2 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成400 μg/mL的蛇床子素標準液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取獨活藥材粉末0.125 g，置10 mL具塞試管中，加60%甲醇定容至10 mL，超聲40 min，稱定重量，聲提取40min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3 結(jié)果

3.1 測定波長的選擇

分別精確量取對照品溶液及供試品溶液各0.2 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，在波長為200～400 nm范圍內(nèi)掃描，對照品溶液和供試品溶液均在315～325 nm范圍內(nèi)有明顯吸收，吸收峰在320 nm附近，故選擇320 nm作為測定波長。

3.2 方法學驗證

3.2.1 標準曲線

精密吸取一定量蛇床子素標準液置10m1容量瓶中，加入甲醇稀釋得到3、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 μg/m1溶液。以甲醇為空白對照，繪制標準曲線:y=0.0331x－0.0089(r=0.9995)。結(jié)果表明蛇床子素質(zhì)量濃度在3～60ug/m1范圍內(nèi)，呈良好的線性。

3.2.2 精密度

精密吸取8μg/m1對照品溶液200 μ1，加入到96孔板中，320nm波長下測定吸光度，重復(fù)測6次，吸光度值RSD 為0.27%。

3.2.3 重復(fù)性

取同一批藥材6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，測定總香豆素的含量為2.17%，RSD為1.83%，表明該方法重復(fù)性好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液0.2 mL，按標準曲線制作方法，分別在1，2，6，8，12，16，24 h測定吸光度，考察樣品24 h穩(wěn)定性。經(jīng)計算，RSD=0.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的獨活樣品粉末約0.05g，共6份，置10 mL具塞試管中，分別加入質(zhì)量為1086 μg的標準品，按供試品溶液制備方法，制備含對照品的樣本溶液6份，測定并計算，結(jié)果見表1，平均回收率為98.9%，RSD為 3.00%。

表1 加樣回收實驗結(jié)果

3.3 樣品測定

精密稱取不同來源獨活飲片粉末，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液0.2 mL，按標準曲線制作方法測定其吸光度。利用回歸方程求出供試品溶液中折合蛇床子素的濃度 (總香豆素)，并計算獨活中總香豆素的含量，結(jié)果見表2。

4 討論

本研究以蛇床子素為對照品，利用多功能讀板機，建立了可同時測定96個獨活樣品中總香豆素高通量含量測定分析方法，并對不同產(chǎn)地的獨活飲片進行了總香豆素的含量測定，結(jié)果表明該方法簡便、準確，適用于中藥獨活藥材中總香豆素含量測定。同時發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)即使相同產(chǎn)地的獨活飲片質(zhì)量存在很大差異;不同批次的獨活樣品中總香豆素的質(zhì)量分數(shù)在0.95～3.39%，均值2.69%。該研究結(jié)果表明了所建的高通量的分析方法簡單，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可用于獨活的質(zhì)量控制，為獨活質(zhì)量標準的制定提供參考。

表2 不同產(chǎn)地獨活總香豆素含量

［1］中國藥典 (一部)［S］.2010年版，2010:246－247.

［2］常艷旭，朱子微，李晉，張秋紅，秦緒.高效液相色譜法同時測定獨活中七種有效成分含量及在質(zhì)量評價中應(yīng)用［J］.內(nèi)蒙古大學學報 (自然科學版)，2011，42(2):121－129.

［3］張恭孝，李聚倉，王德才.獨活中總香豆素組分的含量測定［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2010，28(12):2647－2648.

［4］但飛君，蔡正軍，郭軍輝，潘家榮，王力.中藥白根獨活中總香豆素成分的含量測定［J］.三峽大學學報 (自然科學版)，2008，30(6):91－93.