曹志華 (長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434025)

溫小波 (華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州51 0632)

嚴(yán)書林 (長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434025)

殼聚糖 (chitosan)是甲殼素脫乙?；笊傻闹辨湺嗵?是一種重要的天然活性物質(zhì)。目前,由于抗生素的使用帶來的負(fù)面影響越來越突出,對免疫刺激物的研究也越來越受到重視。但殼聚糖在魚類的使用中還處于研究和探索階段[1-5]。目前,有關(guān)殼聚糖對魚體白細(xì)胞吞噬活性和溶菌酶溶菌活力及其他抗病力的研究雖然不少,但有關(guān)黃鱔的研究還未見報(bào)道。為此,本研究在黃鱔 (Monopterus albus Zuiew)飼料中添加殼聚糖,測定其血液白細(xì)胞吞噬活性和血清中溶菌酶活性,初步探討其對黃鱔非特異性免疫機(jī)能的影響,以期為黃鱔的疾病預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

受試黃鱔來源于長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)基地,體重16.8～24.3g,暫養(yǎng)1周后,挑選體色正常、體質(zhì)健壯、健康無病的個(gè)體用于試驗(yàn)。試驗(yàn)所用殼聚糖為自制,其制備方法參考文獻(xiàn)[5-9],具體如下:收集新鮮的蝦殼,先去除蝦殼內(nèi)外表面的異物,然后經(jīng)脫鈣、脫色等工序制成甲殼素,其工藝流程為:蟹殼→水洗→堿浸→水洗→酸泡→脫色→水洗→干燥→粉碎→成品。將甲殼素與50%的氫氧化鈉溶液在三口燒瓶中混合攪拌,在70℃下回流12h,過濾、洗滌、烘干即得所需產(chǎn)品。經(jīng)測定,所提取的產(chǎn)品含殼聚糖38.33g/100g,蛋白質(zhì)32.06g/100g,粗脂肪g/100g,鈣10.74g/100g。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)共分6組 (Ⅰ～Ⅵ),每組3個(gè)平行,共計(jì)18個(gè)水箱 (規(guī)格為60cm×45cm×45cm,箱中放入黑色塑料袋以供黃鱔藏身,水深15cm左右),每箱放魚30尾。各組試驗(yàn)魚分別飼喂在基礎(chǔ)飼料中添加0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0g/100g殼聚糖的對應(yīng)組別飼料,各組別飼料配方詳見表1。各組試驗(yàn)魚每天分別按其體重的2%～3%投喂對應(yīng)組別飼料1次,1h后清除箱中的污物,每隔3d換掉箱中2/3的水。飼養(yǎng)期間水溫控制在23～25℃,充氣泵間歇增氧 (每隔45min增氧10min)。

表1 各組試驗(yàn)飼料原料組成 g/100g

1.3 免疫指標(biāo)測定

在試驗(yàn)開始后0、10、25、50d每次分別從每組黃鱔中隨機(jī)抽取3尾,測定其血液白細(xì)胞的吞噬活性、血清溶菌酶活性和抗菌活性,其測定與計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果與分析

各組黃鱔不同時(shí)間的白細(xì)胞吞噬活性、血清溶菌酶活性和抗菌活性的測定結(jié)果詳見表2。由表2可知,隨著殼聚糖添加量的增加,各組黃鱔白細(xì)胞的吞噬活性、抗菌活性和血清溶菌酶活性出現(xiàn)上升趨勢,在0.5～1.5g/100g時(shí)最高,但當(dāng)殼聚糖的添加量達(dá)到2.0g/100g時(shí),白細(xì)胞的吞噬活性、血清溶菌酶活性和抗菌活性都明顯下降。

表2 各組黃鱔不同時(shí)間的白細(xì)胞吞噬活性、血清溶菌酶活性和抗菌活性

殼聚糖對黃鱔白細(xì)胞的吞噬活性和抗菌活性及溶菌酶的活性隨養(yǎng)殖時(shí)間的不同而出現(xiàn)不同的結(jié)果,同一組在10d、25d和50d的測定結(jié)果有明顯的不同。殼聚糖添加量為0.2g/100g的試驗(yàn)組在不同時(shí)間測定的結(jié)果出現(xiàn)上升趨勢,添加量為0.5g/100g的試驗(yàn)組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定的結(jié)果都比對照組高,而添加量為1.0g/100g和1.5g/100g的2個(gè)試驗(yàn)組白細(xì)胞的吞噬活性和抗菌活性在第10天和第25天的結(jié)果雖比對照組高,但第50天的抗菌活性和白細(xì)胞的吞噬活性則出現(xiàn)明顯下降。殼聚糖添加量為2.0g/100g的試驗(yàn)組,其第10天的白細(xì)胞吞噬活性和抗菌活性比其它時(shí)間段的測定結(jié)果要高 (表2)。

3 討論

魚類的非特異性免疫主要包括體液免疫和細(xì)胞免疫。在細(xì)胞免疫中,血液中的吞噬細(xì)胞起著重要的作用[9]。本研究結(jié)果表明,在飼料中添加適量的殼聚糖能增強(qiáng)黃鱔白細(xì)胞的吞噬活性。5個(gè)添加殼聚糖的試驗(yàn)組,有4個(gè)試驗(yàn)組的黃鱔白細(xì)胞吞噬活性顯著高于對照組。當(dāng)殼聚糖的添加量從0.5g/100g上升到1.5g/100g時(shí),黃鱔的白細(xì)胞吞噬活性也隨之增強(qiáng);但當(dāng)添加量繼續(xù)上升為2g/100g時(shí),PP值和PI值并不增大。從投喂時(shí)間看,當(dāng)投喂時(shí)間大于50d,1.0g/100g組和1.5g/100g組的白細(xì)胞吞噬活性和溶菌酶活性會(huì)下降,而添加2.0g/100g的殼聚糖對黃鱔的非特異性免疫在第10d測定指標(biāo)達(dá)到最高,之后明顯下降。這說明殼聚糖的添加量和使用持續(xù)的時(shí)間都會(huì)影響黃鱔的免疫應(yīng)答水平,殼聚糖的添加量在0.5g/100g時(shí),免疫應(yīng)答水平隨著時(shí)間的增加不會(huì)出現(xiàn)下降,而在比較高的添加水平隨著殼聚糖的添加量的逐漸增加,黃鱔的免疫應(yīng)答水平也隨之增強(qiáng),但超出一定時(shí)間后,魚體的免疫應(yīng)答水平不會(huì)持續(xù)上升,反而出現(xiàn)下降。所以要發(fā)揮殼聚糖的免疫刺激作用,使用時(shí)間和使用量是很重要的因素。

溶菌酶是魚類血清中極為重要的非特異性免疫指標(biāo)之一,測定魚類的溶菌酶活性,可以在一定程度上反映魚類非特異性體液免疫狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體受到病源攻擊時(shí),吞噬細(xì)胞的活性增強(qiáng),也導(dǎo)致溶菌酶活性的變化。本研究中,添加適量的殼聚糖使白細(xì)胞吞噬活性和血清溶菌酶活性的變化趨勢基本一致,說明殼聚糖能夠激活吞噬細(xì)胞的吞噬功能和水解酶的活性,增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力。當(dāng)添加量在0.5～1.5g/100g時(shí),在試驗(yàn)開始后第10天、第25天、第50天,添加殼聚糖的各試驗(yàn)組黃鱔溶菌酶活性呈上升趨勢,當(dāng)添加量殼聚糖達(dá)2g/100g時(shí),隨著時(shí)間的增加,高劑量的殼聚糖免疫效果并不會(huì)增強(qiáng),反而出現(xiàn)下降,這一結(jié)果與王樹芹等的研究相符的[3]。也有研究認(rèn)為,將甲殼素注射到金頭鯛體內(nèi),其溶菌酶的活力增強(qiáng),而添加到飼料中無效[4],其與本研究結(jié)果不符的原因可能是因?yàn)闅ぞ厶鞘羌讱に氐拿撘阴；a(chǎn)物,它們的作用機(jī)制有所不同,而且殼聚糖的來源非常廣泛,不同來源及加工工藝提取的殼聚糖會(huì)有一些差異,對魚產(chǎn)生的影響也會(huì)有所不同。

[1]陳 勇,周洪琪,冷向軍,等.殼聚糖對異育銀鯽生長和消化酶的影響 [J].中國水產(chǎn)科學(xué),2006,13(3):440-443.

[2]翟少偉,王 敦,黃滄海.昆蟲殼聚糖對鯽魚生長及腸道消化酶活性的影響 [J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,24(4):566-569.

[3]王樹芹,周洪琪.殼聚糖對異育銀鯽溶菌酶和白細(xì)胞吞噬活性的影響 [J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,13(2):121-125.

[4]Eateban M A,Cuesta A,Ortuno J,et al.Immunomodulatory effects of dietary intake of chitin on gilthend seabrean(Sparus autata L.)innate immune system[J].Fish Shellfish immmunology,2001,11:303-315.

[5]莊承紀(jì),劉勁科,楊清友,等.殼多糖對羅氏沼蝦,斑節(jié)對蝦蝦苗生長和抗菌防病作用的研究[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào),1998,18(3):29-34.

[6]歐陽漣,謝 宇,洪小偉.化學(xué)法制備殼聚糖的研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版),2009,30(6):56-58.

[7]陳東輝,陳 亮.殼聚糖制備方法的比較研究 [J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2002,14(1):56-58.

[8]王 勇,張成鋼,張 舟,等.高活性殼聚糖的制備及特性[J].微生物學(xué)雜志,2001,21(1):27-28.

[9]張子濤,陳東輝.甲殼素脫乙?；捌鋭?dòng)力學(xué)研究 [J].青島大學(xué)學(xué)報(bào),2000,15(4):23-26.

[10]曹志華,文 華,溫小波,等.維生素C對黃鱔非特異性免疫機(jī)能的影響 [J].長江大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版)農(nóng)學(xué)卷,2008,5(4):41-44.