王昌梅，張無敵，陳玉保，尹 芳，徐 銳，劉士清

(云南師范大學 太陽能研究所，云南 昆明 650092)

脂肪酶法制備生物柴油的研究現狀及展望

王昌梅，張無敵，陳玉保，尹 芳，徐 銳，劉士清

(云南師范大學 太陽能研究所，云南 昆明 650092)

脂肪酶法制備生物柴油具有反應條件溫和、醇用量小、甘油易回收和無廢物產生等特點。對用于制備生物柴油的脂肪酶類型(動物脂肪酶、植物脂肪酶及微生物脂肪酶)、用于脂肪酶法制備生物柴油的原料油脂類型(植物油脂、動物油脂、微藻油脂及廢棄油脂)以及脂肪酶法制備生物柴油的方式(游離脂肪酶催化法、固定化脂肪酶催化法、復合脂肪酶協同催化法)進行了綜述;并提出了脂肪酶法制備生物柴油的研究與發(fā)展方向，如對酶制劑的研究、生物柴油原料的解決以及對脂肪酶的使用方式進行改進，為今后脂肪酶法制備生物柴油的研究提供思路。

脂肪酶;生物柴油;酶催化;酯交換

生物柴油與傳統的石化柴油相比具有很多優(yōu)點，發(fā)展生物柴油在我國具有巨大的潛力［1］。生物柴油主要是以動、植物油為原料，通過轉酯化反應制備成的長鏈脂肪酸酯類物質(脂肪酸甲酯或乙酯)。目前生物柴油的制備方法主要有化學法和生物酶法。化學法生產工藝較成熟，是目前制備生物柴油常用的方法;但化學法存在能耗高、工藝復雜、醇消耗量大、污染環(huán)境等缺點。生物酶法制備生物柴油是利用脂肪酶的催化作用，實現油脂與短鏈脂肪醇的轉酯化反應，具有反應條件溫和、醇用量少、產物易分離、環(huán)保等優(yōu)點。脂肪酶法對原料要求低，游離脂肪酸完全可以被脂肪酶直接酯化，副產物甘油分離簡單，降低了生產工藝要求和生產成本，因而脂肪酶法制備生物柴油被認為是取代化學法生產生物柴油的綠色工藝［2］。但脂肪酶法合成生物柴油也存在一些缺點：目前使用的脂肪酶僅對長鏈脂肪醇的轉酯化反應有效，而對短鏈脂肪醇的轉化率低;短鏈脂肪醇對脂肪酶有一定的毒性，使脂肪酶的使用壽命縮短;副產物甘油和水不但抑制產物形成，而且甘油對脂肪酶有毒性，也影響脂肪酶的使用壽命［3］。

本文對脂肪酶法制備生物柴油的研究現狀進行了綜述，并提出了將來的研究方向。

1 脂肪酶法制備生物柴油研究現狀

脂肪酶全稱為甘油三酰水解酶，其基本功能是催化甘油酯水解為甘油和脂肪酸。脂肪酶最早應用于油脂工業(yè)是催化油脂水解生產脂肪酸［4］。隨著非水相酶學研究的深入以及對脂肪酶催化過程的熱力學和動力學的研究，發(fā)現在一定的反應體系中，利用脂肪酶的催化作用，還可實現油脂與短鏈醇的酯交換反應，用于制備生物柴油［5］。脂肪酶催化制備生物柴油的反應機理通常認為是多個順序水解和酯化過程，即在酶催化微水環(huán)境中，三甘酯先水解成二甘酯和脂肪酸，然后脂肪酸和短鏈醇酯化合成脂肪酸烷基酯;二甘酯繼續(xù)水解成單甘酯和脂肪酸，脂肪酸再與短鏈醇酯化合成脂肪酸烷基酯;依次進行順序水解和酯化反應，直到甘油酯完全水解為甘油，產生的脂肪酸完全酯化合成脂肪酸烷基酯。甘油酯與短鏈醇還可以直接進行酰基轉移，因為醇作為?；荏w，除了參與和脂肪酸的酯化過程，同時有可能與水競爭獲得甘油酯的?；?，即不經水解步驟直接產生脂肪酸烷基酯和二甘酯。

1.1 用于制備生物柴油的脂肪酶

脂肪酶廣泛存在于動物肝臟、植物種子和微生物中［5］。不同來源的脂肪酶具有不同的催化特點和催化活性。目前，用于催化制備生物柴油的脂肪酶主要有Novozym 435［6-7］、南極假絲酵母Candida antarctia［8-9］、Candida rugosa［10］、固定化假絲酵母Candida sp.99-125［11］、米根霉Rhizopus oryzae［12-13］、米 根 霉 IFO4697［14-15］、 華 根 霉 CCTCC M 201021［16］、葡枝根霉 YF6［17］、洋蔥假單胞菌Pseudomonas cepacia［18-21］、熒 光 假 單 胞 菌LipB52［22］;此外，還有豬胰脂肪酶［23-24］、Penicillium Expansum TS414［25］和Enterobacter agglomerans［26］。它們催化油脂轉酯化反應得到脂肪酸甲酯的收率一般為70% ～100%［27］。

1.2 用于脂肪酶法制備生物柴油的原料油脂

1.2.1 植物油脂

來源于植物的油脂是較好的制備生物柴油的原料。生產生物柴油原料的植物要具備生長快、單產高、含油量高的條件。不飽和脂肪酸含量高的油脂可避免冬季氣溫下降而凝固，油酸含量高的油脂所制備的生物柴油具有良好的貯存穩(wěn)定性及燃燒特性［28］。大豆油、棕櫚油、棉籽油、葵花籽油、紅花籽油、菜籽油、花生油、蓖麻籽油皆可作為脂肪酶法制備生物柴油的原料。此外，一些木本植物油脂(如桐油、麻瘋樹籽油)，其中含有佛波酯而不可食用，但油酸含量較高，也是制備生物柴油較好的原料［12］。劉偉濤等［29］研究了固定化Lipozyme TLIM和Novozym 435脂肪酶催化毛棉籽油和乙酸甲酯制備生物柴油，生物柴油收率達到91.83%。李俊奎等［30］研究了以石油醚提取的小桐子毛油和甲醇為原料，利用固定化Candida sp.99-125脂肪酶催化合成生物柴油，最高收率可達93%;該脂肪酶連續(xù)使用14個批次，生物柴油收率仍可保持在70%以上。

1.2.2 動物油脂

動物油脂中飽和脂肪酸含量較高，是制備生物柴油的原料之一。但目前以動物油脂為原料，采用脂肪酶法催化制備生物柴油的報道并不多。Lu等［31］以豬油為原料，在Candida sp.99-125脂肪酶催化下制備生物柴油，生物柴油收率達87.4%。Shimada等［32］以金槍魚油為原料，采用固定化Candida antarctica脂肪酶逐步醇解工藝，生物柴油收率達90%。俞凌云等［24］以混合豬油、菜籽油為原料，采用豬胰脂肪酶催化制備生物柴油，油脂轉化率偏低，只有36%。

1.2.3 微藻油脂

微藻油脂是制備生物柴油的另一原料來源。Li等［33］報道，利用Chlorella protothecoids微藻油脂，在固定化Candida sp.99-125脂肪酶催化下制備生物柴油，油脂轉化率達98%，且該微藻油脂中的油脂質量分數達44%～48%(基于細胞干重)。借助基因工程和遺傳工程技術及光照培養(yǎng)技術，培養(yǎng)繁衍能力強、油脂含量高、生長周期短的工程微藻，降低微藻生物柴油的生產成本，比用植物油脂生產生物柴油更具有商業(yè)競爭力。

1.2.4 廢棄油脂

餐飲業(yè)廢棄的食用油、地溝油以及植物油脂加工后的油腳可作為制備生物柴油的原料。雖然原料成本低，但這些原料中聚合物和游離脂肪酸含量高、黏度大，進行轉酯化反應前必須進行預處理，如用硅酸鎂吸附除去游離脂肪酸等雜質，否則易導致催化劑失活［34］。韓春陽等［35］以餐飲廢油為原料，用固定化Novozym 435與TLIM脂肪酶催化制備生物柴油，脂肪酸甲酯收率達85.7%;該脂肪酶在連續(xù)反應266 h后，催化活性基本沒有下降。蘇敏光等［36］利用中性脂肪酶催化泔水油與甲醇反應制備生物柴油，生物柴油收率可達89.7%以上。

1.3 脂肪酶法制備生物柴油的方式

1.3.1 游離脂肪酶法制備生物柴油

游離脂肪酶通過催化雙相體系油水界面的轉酯化反應制備生物柴油?；谟退缑婊罨奶攸c，脂肪酶催化制備生物柴油的反應速率較快，不受底物和產物的擴散限制，產物與副產物分離簡單。Kaieda等［37］利用游離 Rhizopus oryzae脂肪酶催化大豆油和甲醇的轉酯化反應時發(fā)現，水的存在(質量分數為4%～30%)有利于反應的進行。他們還比較了 3種游離脂肪酶 Candida rugosa，Pseudomonas cepacia，Pseudomonas flurescenes在無溶劑體系中催化大豆油和甲醇轉酯化反應的性能，發(fā)現 Pseudomonas cepacia和 Pseudomonas fluorescenes脂肪酶對甲醇的穩(wěn)定性非常好，其中又以Pseudomonas cepacia脂肪酶的穩(wěn)定性最好，大豆油的轉化率最高。蘇敏光等［36］利用游離中性脂肪酶催化泔水油與甲醇反應制備生物柴油，通過正交實驗獲得最佳反應條件：油與醇的摩爾比1∶3，油與酶的質量比1∶1，溫度45℃，油與溶劑的質量比1∶0.6。在此條件下反應10 h，生物柴油收率可達89.7%以上。吳良彪［38］利用游離脂肪酶催化食用廢油與甲醇反應制備生物柴油，得到最佳反應條件：溫度50℃，脂肪酶催化劑用量為原料質量的3%，甲醇與食用廢油的體積比為3∶1，共溶劑丁酮與甲醇的體積比為1∶6，pH=7，反應時間4 h。在此條件下，生物柴油收率達78%，產品的各項指標均與 0#石化柴油相接近。呂丹等［39］采用游離NS81006脂肪酶催化含酸油脂制備生物柴油，生物柴油收率達 90%，通過離心分離可有效實現NS81006脂肪酶的回收使用，連續(xù)回用5個批次，游離脂肪酶活性未出現明顯下降。

游離脂肪酶在反應體系中分散不均勻且容易聚集結塊，不利于回收和重復利用;并且甲醇對脂肪酶具有失活效應，限制了脂肪酶在工業(yè)規(guī)模生物柴油生產中的應用。通過固定化技術和全細胞催化劑的采用、甲醇流加方式的改進等手段，可改善脂肪酶的催化活性和穩(wěn)定性，從而降低生產成本，加快生物柴油工業(yè)化進程。

1.3.2 固定化脂肪酶法制備生物柴油

酶是高效、專一性強的生物催化劑，但是自由酶在水溶液中很不穩(wěn)定，可溶性酶一般只能起一次催化作用。同時酶是蛋白質，在高溫、高離子濃度、強酸、強堿等條件下及部分有機溶劑中均不穩(wěn)定，容易失活而降低其催化活性，這些不足大大限制了酶促反應的廣泛應用［40］。20世紀70年代出現的固定化酶技術克服了游離酶的不足。固定化細胞技術是指用物理或化學方法將游離細胞固定于限定的空間區(qū)域，并使固定后的細胞擁有良好的催化活性和重復使用性的一種方法［41］。近年來在生物柴油的制備研究中固定化酶有所應用，有望成為一種新型、高效、無污染、低成本的生物柴油工業(yè)化生產方法［42-44］。

溶膠-凝膠法制備固定化脂肪酶工藝簡單，固定化脂肪酶的力學性能穩(wěn)定、生物相容性好，已成為脂肪酶固定化的熱點研究領域之一。Noureddini等［19］利用以四甲氧基硅烷和異丁基三甲氧基硅烷為前體的溶膠-凝膠法固定Pseudomonas cepacia脂肪酶，并催化大豆油轉酯化反應，脂肪酶的穩(wěn)定性和催化活性顯著提高，重復使用11次后，活性僅喪失5%。Yagiz等［45］以人工合成水滑石為載體固定化Lipozyme TLIM脂肪酶，考察了溫度、pH、粒徑、時間對固定化效率的影響，并用該固定化脂肪酶催化廢油脂的轉酯化反應，室溫(24℃)下反應105 h后轉化率達92.8%，重復使用7次后，殘余酶活為36%。高陽等［46］以非極性大孔樹脂 NKA為載體，用物理吸附法固定化Candida sp.99-125脂肪酶，該法簡便易行，在低水含量的庚烷體系中進行大豆油的轉酯化反應，單批轉化率為97.3%，連續(xù)反應19個批次，轉化率為70.2%，殘余酶活為85.1%。張寶華等［47］以絲瓜絡為載體，對Pseudomonas fluorescens脂肪酶進行固定化，并催化餐飲廢油制備生物柴油，在40℃、醇與油的摩爾比3∶1、水質量分數0.4%、無溶劑條件下，脂肪酸甲酯收率最高達88.7%，重復使用10次后脂肪酸甲酯收率達85.5%，適合于工業(yè)化應用。李治林等［48］以硅藻土、聚氨酯樹脂、氧化鋁和海藻酸鈉4種載體固定化米根霉細胞，其中聚氨酯樹脂為適宜的載體，在80 m L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入聚氨酯樹脂0.6 g時所制備的固定化細胞性能最佳，此時固定化細胞干質量為0.556 g，培養(yǎng)液酶活為17.4 U/m L;將此固定化細胞用于催化大豆油甲酯化反應，在甲醇與大豆油的質量比5∶1、甲醇分批加入(每12 h加1批)的情況下，脂肪酸甲酯收率可達94%。

1.3.3 復合脂肪酶協同催化法制備生物柴油

復合脂肪酶協同轉酯化作用可解決單一脂肪酶受?；D移速率的影響而導致轉化效率低的問題。對復合脂肪酶與單一脂肪酶的催化效果進行比較研究，可探索出能有效提高脂肪酶轉化效率的生物酶法新工藝。周位［49］報道，在無溶劑體系中，Novozym 435脂肪酶分別與 Lipozyme TLIM 和Lipozyme RM IM脂肪酶以質量比7∶3混合時，脂肪酸甲酯收率分別達到94.52%和96.25%，比Novozym 435脂肪酶單獨使用時分別提高了9.52%和9.99%。在叔丁醇體系中，當Novozym 435與Lipozyme TLIM脂肪酶分別以質量比6∶4和8∶2混合時，脂肪酸甲酯收率分別為85.06%和81.5%，比Novozym 435脂肪酶單獨使用時分別提高了9.89%和7.48%;優(yōu)化叔丁醇體系中復合脂肪酶催化條件后，脂肪酸甲酯收率達92%。蔣建新等［50］研究了Novozym 435和Lipozyme TLIM混合脂肪酶催化香葉樹籽油制備生物柴油，以叔丁醇為溶劑，最優(yōu)反應條件為：溫度38.5℃、甲醇與油的摩爾比4∶1、叔丁醇與油的體積比1∶1.5、混合脂肪酶用量為油質量的 4%，此時油脂轉化率達90.09%。當兩種脂肪酶按質量比1∶3混合時，具有協同催化作用，既可提高反應轉化率，又可降低酶的使用成本。

2 脂肪酶法制備生物柴油的發(fā)展方向

脂肪酶法制備生物柴油已成為國內外研究者關注的熱點，并已取得很多研究成果，特別是獲得了許多催化活性極高的不同來源的脂肪酶，為脂肪酶法制備生物柴油的產業(yè)化進程奠定了堅實的基礎。今后的研究方向應為：(1)對酶制劑的研究。利用DNA重組技術可生產重組脂肪酶，降低酶的生產成本，改變其熱穩(wěn)定性、脂肪酸鏈長度專一性、底物專一性、醇鏈長度專一性、醇耐受性及pH穩(wěn)定性。對于已發(fā)現的催化活性高、連續(xù)生產酶活損失少的脂肪酶，還應繼續(xù)降低其制造成本和使用成本，即進一步提高酶的循環(huán)利用性能。(2)原料的解決。鑒于國家產業(yè)政策不允許利用食用油生產生物柴油，應加大對非食用油脂及廢棄油脂的研究應用，如餐飲廢油、地溝油等的脂肪酶催化轉化研究;還可加大以動物油脂為原料，使用脂肪酶法制備生物柴油的研究。(3)對脂肪酶的使用方式進行改進。脂肪酶固定化技術的成功與否是脂肪酶法合成生物柴油能否得以工業(yè)化應用的關鍵，獲得廉價、易于活化和制備的固定化脂肪酶是今后的研究重點。

3 結語

隨著石油資源的日益枯竭以及人們對環(huán)境保護的日益關注，可再生、環(huán)境友好的生物柴油已被認為是一種新的可替代石化柴油的清潔燃料，國內外已建成了各種規(guī)模的生物柴油生產廠。隨著脂肪酶法合成生物柴油技術的發(fā)展與產業(yè)化進程的推進，脂肪酶法制備生物柴油將會以其高效、安全、節(jié)能、環(huán)保、低成本等優(yōu)點得到廣泛推廣應用。

致謝 本文的完成得到云南師范大學太陽能研究所、生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心、云南省生物質能與環(huán)境生物技術重點實驗室、云南省農村能源工程重點實驗室以及云南師范大學生物質能創(chuàng)新教學團隊全體成員的大力支持。

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Research Status of Biodiesel Production by Lipase Method and Its Prospect

Wang Changmei，Zhang Wudi，Chen Yubao，Yin Fang，Xu Rui，Liu Shiqing

(Solar Energy Research Institute，Yunnan Normal University，Kunm ing Yunnan 650092，China)

Lipase method for biodiesel production has the advantages of mild reaction conditions，low alcohol use level，easy glycerol recovery，no waste material production and so on.The lipase type (come from animals，plants and microorganisms)，raw oil type(vegetable oils，animal fats，algae oils and waste oils)and the lipase catalysis type(free enzyme catalysis，immobilized enzyme catalysis and composite lipase concerted catalysis)were summarized.It was pointed out that the research of enzyme preparation，sources of the raw materials for biodiesel production and the using method of the lipases would be the tendency of the research and development of biodiesel production catalyzed by lipase.

lipase;biodiesel;enzyme catalysis;transesterification

1000-8144(2011)08-0907-05

TQ 426.97

A

2011-03-15;［修改稿日期］2011-05-28。

王昌梅(1975—)，女，云南省永善縣人，博士生，電話15969431782，電郵 wangcmzf@gmail.com。聯系人：張無敵，電話13508714255，電郵wooti@ynnu.edu.cn。

云南省應用基礎研究基金項目(2010CD050);云南省能源局“地溝油制取生物柴油裝備研發(fā)及推廣項目”(20102127)。

(編輯 安 靜)

石油化工新材料