苗麗娟

（吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林 吉林 132101）

豬圓環(huán)病毒（PCV）為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動物DNA病毒。該病毒基因組為單股環(huán)狀DNA，無囊膜，粒子呈20面體對稱，直徑17～20 nm。根據(jù)PCV的抗原性、核苷酸序列及致病性，將PCV分成PCV1和PCV2兩種基因型。PCV1無致病性，PCV2具有致病性。PCV2與近年來在世界各國普遍發(fā)生的PCV感染密切相關(guān)。該病主要以進行性消瘦和多系統(tǒng)病理損傷為特征，已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成相當嚴重的經(jīng)濟損失。PCV2還可以造成育肥豬皮炎與腎炎綜合征，并與懷孕母豬的繁殖障礙、新生仔豬的先天性震顫、新生仔豬腹瀉病、增生性壞死性肺炎的發(fā)生密切相關(guān)。隨著該病的出現(xiàn)，人們越來越重視對豬圓環(huán)病毒的研究[1]。

PCV在臨床癥狀上容易與一些疾病混淆，如豬瘟等。僅通過臨床癥狀、病理剖檢很難做出準確診斷，因此實驗室診斷方法是PCV的重要診斷方法。診斷PCV的方法大致分成血清學方法與分子生物學方法兩類。血清學診斷方法包括免疫組織化學檢測（IHC）、酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）和間接免疫熒光（IFA）等。分子生物學診斷方法包括PCR、RT－PCR和熒光定量PCR等，是通過檢測組織病料及病毒培養(yǎng)物中的病毒核酸來判斷的，還可以采用病毒的分離與鑒定的方法。

1 病毒的分離與鑒定

將病死豬組織（肺、淋巴結(jié)等）與PBS 1∶5研磨，凍融3次，8 000 rpm離心15min，取上清。接種于無PCV污染的PK－15細胞，同時加入1/10體積的300mmol·L－1D－氨基葡萄糖。通常在病料接種后3 d，通過IFA、PCR或電子顯微鏡觀察等方法確認病毒分離情況。病毒分離費時費力，不適于疾病的快速診斷。

2 血清學方法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附方法

酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）是以抗體抗原反應為原理的技術(shù)，是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后產(chǎn)生的一種檢測抗體或抗原的免疫酶技術(shù)，該技術(shù)簡單、靈敏、快速。血清學方法中最主要的是ELISA法，主要包括競爭ELISA、間接ELISA、抗原捕獲ELISA等。

2.1.1 競爭ELISA

競爭ELISA主要用于測定小分子抗原及半抗原。用特異性抗體致敏固相載體，加入含待測抗原的樣品及一定量的酶標抗原共同培養(yǎng)，洗滌除去標記和未標記的抗原，加底物顯色。Walker等首次利用PCV1和PCV2特異性單克隆抗體建立了競爭ELISA（c－ELISA）方法來檢測PCV2抗體，并將這種方法和IFA方法相比，檢測結(jié)果表明，該方法比IFA更敏感，可用于PCV2抗體的大規(guī)模檢測[2]。

2.1.2 間接ELISA

間接ELISA主要用于測定抗體。用抗原致敏固相載體，然后加入待測抗體的血清，培養(yǎng)后洗去未結(jié)合成分，再加入酶標抗體，洗滌后加入底物，在酶的催化下底物發(fā)生反應，產(chǎn)生有色物質(zhì)。Nawagitgul等報道了兩種間接ELISA法，一種以細胞培養(yǎng)的PCV2全病毒作為抗原（PCV2－ELISA），另一種以O(shè)RF2重組桿狀病毒表達產(chǎn)物作為包被抗原（ORF2－ELISA），分別用于檢測針對全病毒和病毒核衣殼蛋白的抗體。試驗結(jié)果顯示，ELISA方法敏感性高、重復性好，并且與PPV及PRRSV的抗體無交叉反應[3]。但是，由于PCV2 ELISA不能有效區(qū)分PCV1與PCV2抗體，并且PCV2病毒培養(yǎng)物滴度低，純化困難，因此該方法的應用受到很大限制。

2.1.3 抗原捕獲ELISA

有研究人員利用單抗建立了抗原捕獲ELISA方法檢測PCV2特異抗體。McNeilly等以PCV2特異性單抗為工具建立了抗原捕獲ELISA用于仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的診斷，發(fā)現(xiàn)抗原捕獲ELISA與病毒分離、IHC一樣能很好地鑒別PMWS與PCV2的亞臨床感染[4]?？乖东@ELISA的建立為PMWS與PCV2的亞臨床感染的鑒別診斷提供了很好的手段。

2.2 間接免疫熒光

間接免疫熒光（IFA）主要利用已知抗原來檢測待檢血清的抗體，用于病毒分離效果的鑒定及病變組織或豬源細胞PCV感染情況的檢測。陳慶新等將浙江省杭州地區(qū)28個豬場采集豬血清1 677份用IFA試驗進行PCV2的抗體檢測，檢測出陽性血清960份，陽性率為55.48%，調(diào)查結(jié)果顯示，杭州地區(qū)豬場為普遍感染[5]。這種方法成本低、簡單、快速、靈敏，但實際操作復雜，因此不適合臨床上的快速診斷。

2.3 免疫組織化學檢測

免疫組織化學檢測（IHC）與IFA一樣，也是一種免疫染色方法，是在抗原抗體特異性反應的前提下，利用酶細胞化學的手段，檢測抗原或抗體的一門新技術(shù)。IHC是可以對攜帶抗原的細胞及組織的形態(tài)進行大體的評價，而且在普通顯微鏡下就可以進行觀察，且顏色穩(wěn)定，樣本易保存。有學者應用IHC法對PMWS患病豬的淋巴組織進行了檢測，發(fā)現(xiàn)淋巴組織中單核巨噬細胞內(nèi)和組織細胞內(nèi)PCV2的陽性信號很強，說明PCV2主要存在這些細胞的細胞漿內(nèi)。

2.4 免疫過氧化物酶單層試驗

免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）是將生長有PCV病毒的PK－15細胞在96孔板上長成單層后，加入10倍稀釋的待檢豬血清，作用一定時間后吸干洗滌，再加入HRP標記的抗豬IgG，37℃孵育30min，吸干洗滌后加入底物溶液顯色，然后終止反應。劉長明等在優(yōu)化此檢測方法的基礎(chǔ)上，研制出一種新的IPMA抗體檢測試劑盒，該試劑盒用于豬血清中PCV－2抗體檢測，具有特異、敏感、操作簡便、實用性強等特點[6]。

3 分子生物學診斷方法

主要應用分子生物學方法來檢測組織病料或培養(yǎng)物中的病毒核酸。

3.1 聚合酶鏈反應

聚合酶鏈反應（PCR）是一種快速、簡便、特異的診斷方法，可直接檢測病毒核酸，在獸醫(yī)臨床檢測病原中廣泛應用。經(jīng)過多年研究，已建立了多種形式的PCR方法，主要包括常規(guī)PCR、多重PCR、套式PCR、熒光定量PCR及PCR－RFLP等方法。

3.1.1 常規(guī)PCR

常規(guī)PCR是通過設(shè)計合成一對特異性引物，直接從病料或細胞中擴增PCV2特異的基因組片段，以達到特異檢測PCV2的目的。Morozov從PCV－PK－15DNA鏈上設(shè)計特異性引物進行PCR反應，可直接檢測組織病料及其細胞培養(yǎng)物中的病毒核酸。

3.1.2 多重PCR

多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，主要是通過在同一反應中加入多對引物從而同時檢測2種或2種以上病毒DNA。由于這種方法方便、快捷，已經(jīng)廣泛應用于醫(yī)學臨床，給疾病的快速診斷帶來了方便。

3.1.3 套式PCR

套式PCR克服了由于組織病料或細胞中的PCV2模板DNA含量太少，而不能檢測到PCV2基因組存在的特點。方法是設(shè)計兩套引物，先用第1套引物進行PCR，然后取少量PCR產(chǎn)物作為模板，用第2套引物即套式引物再進行PCR。套式PCR較常規(guī)PCR及復合PCR更為敏感。

3.1.4 熒光定量PCR

熒光定量PCR方法具有良好的特異性和重現(xiàn)性，與普通PCR相比，特異性和靈敏度都更高一些，而且能夠有效減少試驗過程中產(chǎn)生的污染，便于觀測，能實時地監(jiān)測反應全過程。羅玉均等建立了TaqMan實時熒光定量PCR方法檢測PCV－2[7]。

3.1.5 PCR－RFLP分析方法

PCR－RFLP是指先以PCR快速而有效的擴增微量DNA，再利用限制酶進行多態(tài)性分析的試驗方法。王新等借助RFLP方法對PK－15細胞、IBRS－2細胞以及疑似PMWS、豬皮炎腎炎綜合征（PDNS）的病料進行了PCV檢測以及血清型的鑒定[8]。

3.2 原位雜交

原位雜交（ISH）是利用核酸分子單鏈之間互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵形成穩(wěn)定的雜交雙鏈。ISH具有敏感性高和精確定位PCV病毒或PCV及PRRSV病毒DNA或RNA在細胞中的部位的特點，為進一步深入研究PCV的致病機理及與PPV或PRRSV之間的協(xié)同效應提供了幫助。肖馳等建立了CSF－PRRS－PCV2診斷DNA芯片，能同時檢測 PRRS、CSF和PCV－2感染[9]。

4 小結(jié)

目前PCV2和其相關(guān)的疾病已在全世界范圍內(nèi)發(fā)生和流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的威脅，引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。因此，建立一種簡單、靈敏、經(jīng)濟、實用，適合臨床推廣的快速檢測方法仍是目前研究的主要任務和方向。雖然目前檢測PCV的方法很多，但各種方法都有其自身的局限性，因此要根據(jù)試驗的目的要求，結(jié)合具備的條件選擇適宜的檢測方法檢測PCV，做到早發(fā)現(xiàn)，早治療，力爭從根本上解決該病的防控問題。

[1]郭春艷,葛俊偉,李一經(jīng).豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2009,40（6）:79－84.

[2]Walker IW,Konoby CA,Jewhurst V A,et al.Developmentand application of a competitive enzyme－linked immunosorbent assay for the detection of serum antibodies to porcine circovirus type 2[J].JVet Diagn Invest,2000,12（5）:400－405.

[3]Nawagitgul P,Harms PA,Morozov I,etal.Modified indirect Porcine Circovirus（PCV）type 2－based and recombinant capsid protein（ORF2）－based enzyme－linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV[J].Clincal and Vaccine Immunology,2002,9（2）:33－40.

[4]McNeilly F,McNair I,O′Connor M,et al.Evaluation of a porcine circovirus type 2 specific antigen capture enzyme－linked immunosorbent assay for the diagnosis of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs:Comparison with viius isolution,immunohistochemistry,and the polymerase chain reaction[J].JVet Diagn Invest,2002,14（2）:106－112.

[5]陳慶新,商紹彬,葉菊秀,等.杭州地區(qū)豬Ⅱ型圓環(huán)病毒抗體的血清學調(diào)查[J].中國獸醫(yī)科技,2003,33（7）:26－28.

[6]劉長明,張超范,危艷武,等.豬圓環(huán)病毒2型免疫過氧化物酶單層細胞試驗抗體檢測試劑盒的研制及應用[J].中國預防獸醫(yī)學報,2007,29（8）:621－624.

[7]羅玉均,張桂紅,陳建紅,等.Taqman探針熒光定量PCR快速檢測豬圓環(huán)病毒2型[J].中國獸醫(yī)雜志,2007,43（1）:77－79.

[8]王新,郭萬柱,徐志文,等.應用PCR－RFLP方法對四川豬圓環(huán)病毒的檢測與分型研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2006（6）:77－83.

[9]肖馳,曹三杰,文心田,等.PRRS－CSF－PCV2診斷DNA芯片構(gòu)建研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,2006,37（8）:799－803.