張孝平，張文靜，陳寶安* ，柏志斌，馮繼峰，程 璐

(1東南大學醫(yī)學院附屬中大醫(yī)院，南京210009;2東南大學醫(yī)學院腫瘤系;3江蘇省腫瘤研究所;4東南大學生物科學與醫(yī)學工程學院生物電子學國家重點實驗室)

胰腺癌(PC)臨床發(fā)病隱匿，發(fā)展迅速，預后極差。據(jù)統(tǒng)計，2009年美國新增PC患者42 470例，83%的患者在1年內(nèi)死亡［1］。目前，手術切除是PC唯一可治愈性方法，但85%的患者就診時已屬晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，手術切除率為10% ～15%。因此，化療在PC綜合治療中占有重要地位。近年來，盡管PC的一線化療方案多以吉西他濱為基礎，但氟尿嘧啶類藥物5-FU、卡培他濱等仍是PC化療中最常用藥物。二氫嘧啶脫氫酶(DPD)及亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是氟尿嘧啶類藥物體內(nèi)代謝的關鍵酶，為探討PC細胞株中二氫嘧啶脫氫酶(DPYD)基因、MTHFR基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點基因型，2010年12月～2011年8月，我們進行了相關研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 新生小牛血清(杭州四季青公司)，RPMI-1640液(美國 Gibco公司)，0．25%胰酶(Sigma公司)，DNA 提取試劑盒、dNTP、Taq DNA 酶(德國Qiagen公司)。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng)及基因組DNA提取 PC細胞株SW1990、PANC-1、CFPAC由東南大學醫(yī)學院實驗室傳代培養(yǎng)。將細胞接種于10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁細胞用0．25%胰蛋白酶消化傳代。采用德國Qiagen公司產(chǎn)試劑盒提取基因組DNA。

1．2．2 PCR擴增及產(chǎn)物純化 采用Assay Designer軟件設計PCR引物，PCR引物由上海邃志公司合成，PCR引物序列(略)。PCR反應體系中含有5 ng模板 DNA 的 1 μl、水 0．95 μl、PCR 緩沖液 0．625 μl、2．5 mmol/L 的 dNTP 1 μl、25 mmol/L 的 MgCl20．325 μl、PCR 引物 1 μl及 HotStar Taq 酶 0．1 μl。PCR反應條件為:94℃預變性15 min，94℃變性20 s、56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行45個循環(huán);最后72℃延伸3 min。反應體系包括1．53 μl水、0．17 μl SAP 緩沖液、0．3 U 堿性磷酸酶;該反應在37℃進行40 min，然后85℃、5 min使該酶失活。堿性磷酸酶處理后，對SNPs行單堿基延伸:94℃預變性30 s，94℃變性5 s，52℃退火5 s，80℃延伸5 s，共40個循環(huán);最后72℃延伸3 min。

1．2．3 樣本分析 采用美國 Sequenom公司產(chǎn)MassARRAY系統(tǒng)，將最終的分型產(chǎn)物點樣到一塊384孔的spectroCHIP上，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)進行分析;結(jié)果由MassARRAY RT軟件讀取并完成基因分型分析。

2 結(jié)果

2．1 PC細胞株DPYD基因的SNPs位點基因型SW1990、PANC-1、CFPACPC細胞株 DPYD基因的rs1801159位點基因型均為A/A純合子，rs1801160位點基因型均為G/G。CFPAC細胞株DPYD基因的rs17376848位點基因型為A/G，PANC-1、SW1990細胞株的rs17376848位點為A/A純合子。

2．2 PC細胞株MTHFR基因的SNPs位點基因型 PANC-1、CFPACPC細胞株 MTHFR基因的rs1801131位點基因型為A/C雜合子，rs1801133位點基因型為C/C;SW1990細胞株MTHFR基因的rs1801131位點基因型為A/A純合子，rs1801133位點基因型為T/T純合子;三株細胞MTHFR基因的rs2274976基因型位點均為G/G純合子。

3 討論

在腫瘤化療中，相同病理類型、分期及方案化療患者的療效、生存期和毒副反應有時截然不同，即“同藥不同效”現(xiàn)象。這種現(xiàn)象與抗腫瘤藥物在腫瘤患者的藥動學和藥物效應毒性個體差異有關［2］，相關基因的SNPs是其產(chǎn)生的主要原因。藥物代謝酶參與多種藥物的代謝活化或解毒，其酶基因多態(tài)性對腫瘤化療反應及預后的影響正引起越來越多學者的關注。

DPD是5-FU代謝失活的限速酶，約80%的藥物在肝臟中經(jīng)DPD分解代謝為無活性產(chǎn)物二氫氟尿嘧啶。DPD由DPYD編碼產(chǎn)生，DPYD堿基突變可能引起DPD結(jié)構及活性改變。目前發(fā)現(xiàn)，至少40余種突變與DPD活性下降及氟化嘧啶類藥物毒性反應有關。Saif等［3］對1例應用5-FU后發(fā)生嚴重血液及神經(jīng)系統(tǒng)毒副作用的晚期PC患者進行DPYD檢測，發(fā)現(xiàn)DPYD IVS14+1 G＞A及DPYD*2A是引起DPD缺乏的最常見多態(tài)性。Shahrokni等［4］報道1例與5-FU治療相關的心臟毒副反應的PC患者，認為DPYD p453L(1358 C＞T)可能是5-FU為基礎化療發(fā)生嚴重毒副作用的潛在因素。

MTHFR是葉酸代謝的關鍵酶，其基因多態(tài)性與葉酸濃度及其在細胞內(nèi)的分布有關，進而影響腫瘤細胞生長。目前發(fā)現(xiàn)，C677T、A1298C是常見與MTHFR活性相關的 SNPs。Suzuki等［5］研究認為，包括MTHFR在內(nèi)的一碳代謝相關基因多態(tài)性可改變飲酒與PC發(fā)生危險性的相關性。另有研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T與 PC發(fā)病危險性相關［6］。此外，MTHFR可將還原型葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四氫葉酸，削弱5-FU的抗腫瘤作用，影響患者對化療的敏感性。

MALDI-TOFMS是近年生物大分子檢測領域開展的新技術，目前，國外已利用該技術的高精確度和靈敏度進行基因組SNPs檢測［7］;有關研究檢測的DPYD基因的三個SNPs位點［A1764C(rs1801159)、G2331A(rs1801160)、T2033A(rs17376848)］及MTHFR基因的三個 SNPs位點［G1965A(rs2274976)、A1515C(rs1801131)及 C894T(rs1801133)］均為基因編碼區(qū)的錯義SNPs，其堿基突變可導致相應的氨基酸改變，可能引起DPD及MTHFR活性改變，影響氟尿嘧啶類藥物的體內(nèi)代謝，且與氟尿嘧啶類藥物的療效及毒副反應相關。本研究采用MALDI-TOFMS對三個PC細胞株的SNPs進行檢測，發(fā)現(xiàn)PANC-1、CFPAC及SW1990細胞株的DPYD基因rs1801159、rs1801160位點基因型及MTHFR基因的rs2274976位點基因型相同，其余SNPs位點基因型均不完全相同。

總之，我們認為檢測PC細胞株中DPYD基因、MTHFR基因的SNPs位點基因型，是腫瘤細胞耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)研究的基礎，可應用于臨床預測氟嘧啶類藥物的療效及毒副反應，使患者在選用最佳藥物方案、劑量及最大限度地降低藥物毒副反應方面受益。因單一藥物基因多態(tài)性對腫瘤化療反應的作用相對較小，故需結(jié)合臨床更大的標本量進行更深入的研究。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al．Cancer statistics［J］．CA Cancer J Clin，2007，57(1):43-66．

［2］Elsayad YA，Sausville EA．Selected novel anticancer treatments targeting cell signalling protein［J］．Oncologist，2001，6(6):517-537．

［3］Saif MW，Ezzeldin H，Vance K，et al．DPYD*2A mutation:the most common mutation associated with DPD deficiency［J］．Cancer Chemother Pharmacol，2007，60(4):503-507．

［4］Shahrokni A，Rajebi MR，Harold L，et al．Cardiotoxicity of 5-fluorouracil and capecitabine in a pancreatic cancer patient with a novel mutation in the dihydropyrimidine dehydrogenase gene［J］．JOP，2009，10(2):215-220．

［5］Suzuki T，Matsuo K，Sawaki A，et al．Alcohol drinking and onecarbon metabolism-related gene polymorphisms on pancreatic cancer risk［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17(10):2742-2747．

［6］Nisevic I，Dinic J，Nikolic A，et al．MTHFR C677T polymorphism in chronic pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma［J］．Cell Biochem Funct，2008，26(6):659-663．

［7］Bray MS，Boerwinkle E，Doris PA．High-throughput multiplex SNP genotyping with MALDI-TOF mass spectrometry:problems and promise［J］．Hum Mutat，2001，17(4):296-304．