李 黎,周晴晴,王艷靜,閆紅霞,石 雨,劉喜龍,康巧珍

(鄭州大學生物工程系,鄭州 450001)

實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠是研究多發(fā)性硬化(MS)的經(jīng)典動物模型,是由同種型、同種異型、異種型神經(jīng)組織抗原誘導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白質(zhì)免疫炎性脫髓鞘性疾病模型。制備EAE動物模型的方法多種多樣,其中利用髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)制備C57BL/6小鼠EAE模型是研究MS免疫發(fā)病機制的理想模型。C57BL/6小鼠對 MOG的敏感抗原表位是 35～55位氨基酸[1]。MOG35～55抗原肽含 21個氨基酸,分子量為2582.4道爾頓。鑒于固相合成法在合成小分子多肽方面具有快速、簡便、高效等優(yōu)點,2010年 9～12月,本研究選用該方法并加以改進,用以制備MOG35～55抗原肽,并以合成的多肽免疫 C57BL/6小鼠,觀察其免疫原性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器、試劑 雌性C57BL/6小鼠16只,8～10周,體質(zhì)量 16～18 g。高效液相色譜儀,凍干機,多肽合成儀,質(zhì)譜儀。Fmoc-氨基酸,DIC, HOBt,DMAP,Wang樹脂,茚三酮,哌啶,吡啶,TFA, DCM,DMF,乙腈,苯酚,KCN,無水乙醇,完全弗氏佐劑(CFA),百日咳毒素(PTX)等。

1.2 方法

1.2.1 MOG35～55的合成 采用改進的Fmoc固相法。鼠源 MOG35～55多肽含 21個氨基酸,序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK。①肽鏈合成：采用Wang樹脂[3]作為固相載體,取代值為 1.51 mmol /g。取Wang樹脂0.25 g,置于多肽合成儀中,加入DMF溶脹20min,將要連接的第1個氨基酸Fmoc-Lys-OH及HOBt用少量DMF溶解,加入合成儀中,再加入DIC,混勻后置搖床振蕩10min,然后加入DMAP,置搖床反應2.5 h;依次用DMF、MeOH、DCM、DMF洗滌(DMF2次,MeOH、DCM各3次,每次2 min);在接肽反應之前用含20%哌啶的DMF溶液脫保護液(20 min,2次),然后加入下一個氨基酸進行縮合。成肽反應使用縮合劑為HoBt、DIC的混合液,反應時間約 3 h。如此重復脫保護、縮合的過程依次由羧基端向氨基端方向延伸至肽鏈組裝完畢。在每一步縮合反應后以茚檢試劑(5%茚三酮乙醇液、80%苯酚乙醇和含2%KCN的吡啶溶液的混合液)檢測呈陰性(溶液為亮黃色,樹脂無藍點)即可進行下一步脫保護。②肽樹脂的切割：切割試劑(TFA、三蒸水、苯甲硫醚、1,2-二硫醇、苯酚,其用量依次為4.95、0.3、0.3、0.15、0.3 m l)配置好放入冰箱中冷凍后加入肽樹脂,室溫下磁力攪拌 3 h左右,然后過濾到冰乙醚中,離心,收集沉淀,凍干,即得到多肽粗品。③產(chǎn)物純化：使用反相高效液相法進行純化分析,色譜柱為C18柱;流動相A為0.1%三氟乙酸(TFA)的超純水溶液,流動相B為0.1% TFA的乙腈溶液;梯度洗脫(以B液濃度為基準)共50min,其中B液25%～70%用時40min,B液70%～70%用時5 min,B液70%～25%用時5 min;檢測波長228 nm。最終用激光解析質(zhì)譜鑒定多肽,用數(shù)據(jù)分析軟件分析合成多肽的分子量。

1.2.2 EAE的誘導 C57BL/6小鼠隨機分為EAE組和正常組,各 8只。MOG35～55多肽用 PBS稀釋后與CFA(結(jié)核桿菌的終濃度為4mg/ml)按等體積混合,用注射器反復抽吸成油包水的乳劑。EAE組每只小鼠注射0.2m l乳劑,其中MOG35～55多肽劑量為300μg/只,分別于鼠背部兩側(cè)皮下注射;在第 1次免疫后0 h和48 h腹腔注射PTX稀釋液0.1 m l, 200 ng/只。正常組注射等量生理鹽水。

1.2.3 實驗鼠體質(zhì)量檢測及神經(jīng)功能評分 實驗鼠自免疫當天開始,每日稱體質(zhì)量,并觀察小鼠的攝食情況,從初次免疫至第 31天實驗終止前,采用盲法,每天2人至少1次在同一時間按Benson評分標準對EAE的嚴重性進行臨床評估,評分≥2分者為EAE發(fā)病。

1.2.4 實驗鼠組織取材與病理學觀察 在EAE模型發(fā)病的高峰期 ,將小鼠經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉后處死 ,迅速取其腦和脊髓,置 4%的多聚甲醛中固定,石蠟包埋后制成6μm厚切片,常規(guī)HE染色,鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。組間比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

成功制備了 MOG35～55抗原肽,精肽產(chǎn)率為13.58%,純度為95%;其分子量為2 582.0道爾頓,與 MOG35～55的理論分子量 2 852.4道爾頓相一致。

EAE組小鼠從免疫后第 15天開始陸續(xù)發(fā)病,至第21天8只小鼠均發(fā)病。發(fā)病后 EAE組小鼠食欲降低、體質(zhì)量減輕、皮毛不光滑、活動量減少。同時EAE組小鼠相繼出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,表現(xiàn)為尾部無力脫垂、步履蹣跚、后肢癱瘓、行動困難,進而發(fā)展為四肢癱瘓,Benson評分最高為4分。正常組小鼠未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,食欲無變化,體質(zhì)量持續(xù)增加,Benson評分為0分。

EAE組小鼠的腦和脊髓實質(zhì)中均有炎性細胞浸潤,病變分布以脊髓頸腰膨大為主,表現(xiàn)為大量淋巴細胞和中性粒細胞浸潤,浸潤沿包膜和小血管由外向內(nèi)延伸,小血管周圍可見血管套形成。正常組小鼠腦和脊髓均未見明顯異常改變。

3 討論

MS的典型病理改變是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性浸潤及脫髓鞘改變。EAE的臨床表現(xiàn)和病理改變與MS極為相似,已成為研究 MS的理想動物模型。在EAE的研究中發(fā)現(xiàn),MOG是惟一既能引起脫髓鞘抗體反應又能引起T細胞反應的中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘蛋白成分[4]。雖然 MOG在髓鞘蛋白中含量很少,但由于它存在于髓鞘膜和少突膠質(zhì)細胞的最外層,故具有高度免疫原性。近年來用MOG誘導的EAE逐漸成為國際上研究 MS的主要模型[5]。

固相合成法在合成多肽中具有快速、簡便、高效等優(yōu)點,但需要對不參與反應的氨基加以保護,同時氨基酸側(cè)鏈上的活性基團也要給予保護。保護基的選擇既要保證側(cè)鏈基團不參與反應,又要保證在肽鏈合成過程中不受破壞,同時還要保證在最后肽鏈裂解時能被除去。本研究參考近年來國內(nèi)外相關(guān)方法,以 Fmoc基團保護α-氨基[6],采用固相合成法合成MOG35～55多肽,并對固相合成法稍作改進(在合成過程中嚴格控制反應步驟,脫保護后盡快洗滌控制在20min左右、茚檢、加入下一個氨基酸;反應時盡量提高反應物濃度,加入最少量的DMF,同時控制搖床溫度和速度),合成的 MOG35～55純度可達95%,精肽產(chǎn)率達13.58%。

本研究中選用的實驗動物 C57BL/6純系小鼠遺傳背景明確,MOG多肽的結(jié)構(gòu)明確并可精確定量,在此基礎上建立的EAE模型更適合從分子免疫學的角度探討 EAE的發(fā)病機制。特別值得注意的是,本研究以合成的 MOG35～55抗原肽制備 C57BL/6小鼠EAE模型均成功,對后續(xù)在某些免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因突變型小鼠中制備EAE模型打下了良好基礎。

總之,本研究采用改進的Fmoc固相合成法,可獲得具有良好免疫原性的 MOG35～55抗原肽,用以制備的C57BL/6小鼠EAE模型穩(wěn)定可靠,為進一步研究MS的免疫學發(fā)病機制奠定了基礎。

[1]Costa O,Divoux D,Ischenko A,et al.Optimization of an animal model ofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisachieved with a multipleMOG35～55peptide in C57BL6/J strain ofmice[J].JAutoimmun,2003,20(1)：51-61.

[2]Han X,Gu J.Application ofsolid-phase peptides synthesis[J].Pro Pharmaceut Sci,2004,28(1)：10-13.

[3]鄭彥慧,張艷平,張浩,等.Fmoc保護氨基酸與Wang樹脂的縮合反應[J].高等學校化學學報,2008,29(9)：1769-1772.

[4]Hjelmstrom P,Juedes TG,Ruddle NH,et al.Cytokines and antibodies in myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental allergic encephalomyelitis[J].Res Immunol,1998,149(9)：794-804.

[5]Adam E,William R,Sergio A,et al.Mice deficient for CCR6 fail to control chronic experimentalautoimmune encephalomyelitis[J].J Neuroimmunol,2009,213(1-2)：91-99.

[6]Chen X,Luo SL,Zhang B,et al.Developmentofsolid-phase polypeptide Synthesis[J].Biotechnology,2006,16(1)：81-82.