邱曉菲,張師前,馬曉晉

(1滕州市中心人民醫(yī)院,山東滕州 277500;2山東大學齊魯醫(yī)院)

在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中存在多個基因的表達異常,實現(xiàn)基因功能表達的最終物質(zhì)是蛋白質(zhì)。因此,直接測定蛋白質(zhì)的水平和活性是了解細胞活動的最好辦法?！安町悺钡鞍踪|(zhì)組學是腫瘤標志物篩選的一個突破口[1]。近年來,以激光捕獲顯微切割(LCM)技術(shù)、雙向凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)為基礎的蛋白質(zhì)組學技術(shù)已廣泛應用于腫瘤的研究。LCM與現(xiàn)代質(zhì)譜相結(jié)合已成為腫瘤標志物篩選的理想技術(shù)[2]。2010年9月,我們采用LCM和MALDI-TOF-MS對高同質(zhì)性宮頸鱗癌組織細胞及正常宮頸細胞進行蛋白質(zhì)組學的比較研究,以期獲取宮頸鱗癌的分子標志物。

1 材料與方法

1.1 宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織的獲取 人宮頸鱗癌組織及癌旁正常宮頸組織取自山東省立醫(yī)院和滕州市中心人民醫(yī)院的宮頸癌手術(shù)切除標本,其中宮頸鱗癌 5例份、癌旁正常宮頸組織 4例份。宮頸癌患者未接受放療或化療。獲取組織 4℃冰鹽水沖洗3～5次,均勻分割成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm組織塊,分裝于 0.5 m l離心管中,先置液氮中速凍,置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 組織切片的制備及染色 取備檢組織,OTC包埋,-25℃切片,厚 8μm。每例標本第1張切片行HE染色,以后每張切片85%、95%(體積分數(shù))乙醇脫水各30 s,無水乙醇2min固定2次。將制備好的組織切片置顯微鏡載物臺,直視下觀察選定要切割的區(qū)域,按最大捕獲效率設定參數(shù)。

1.2.2 細胞捕獲 采用LCM技術(shù)。將切片置于PALM顯微激光切割系統(tǒng) 10×10倍目鏡直視觀察,選定要切割的區(qū)域。按照如下條件進行激光捕獲：激光能量60%,激光脈沖80 steps/sec。每個樣品捕獲 50 000～60 000個細胞。

1.2.3 細胞總蛋白提取 將LCM捕獲的單一類型宮頸癌細胞群及癌旁正常宮頸細胞分別使用組織裂解緩沖液提取總蛋白,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 蛋白雙向凝膠電泳 取上述蛋白質(zhì)樣品100μg加入重泡脹液至終體積 350μl。將樣本均勻加入持膠槽中,膠面向下放入17 cm IPG干膠條,滴加礦物油,置等電聚焦儀,重泡脹過夜。等電聚焦后,IPG膠條分別在平衡液A(含20 g/LDTT)和B(含25 g/L碘乙酰胺)中各平衡15min。將平衡后的IPG膠條置12%的均勻SDS聚丙烯酰胺凝膠上方,膠條端滴加寬范圍的蛋白標記物,低溶點瓊脂糖封閉,電泳參數(shù)：5 mA/膠 1 h,待溴酚藍前沿移入SDS膠時,以30mA/膠6 h直至溴酚藍前沿抵達距膠底邊緣約0.5 cm時為止。

1.2.5 凝膠染色 根據(jù)蛋白質(zhì)銀染試劑盒的操作說明對2-D膠進行銀染。用Proteineer SPSpectrometer掃描凝膠蛋白質(zhì)獲取圖像,確定高度表達的特異蛋白質(zhì)斑點。

1.2.6 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定 選取膠上差異蛋白質(zhì)點,用刀片沿斑點染色邊緣切下,置Eppendof管,按Gharahdaghi等方法進行蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解,37℃孵育過夜。萃取后,合并多肽混合物提取液。利用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀對肽混合物提取液進行分析,獲得寡肽的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸入MASCOT 2.2蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,對該蛋白質(zhì)進行鑒定。

2 結(jié)果

通過LCM技術(shù)可以準確、快速地分離宮頸鱗癌細胞、間質(zhì)組織,得到同質(zhì)性腫瘤細胞。利用雙向凝膠電泳對搜集獲取的單一類型宮頸腫瘤細胞群和正常宮頸細胞配對樣本進行分析后得到蛋白質(zhì)凝膠電泳銀染圖譜。通過掃描凝膠影像,顯示 20個蛋白點的表達量存在明顯差異(P均 ＜0.01)。利用MALDI-TOF-MS成功鑒定出5種差異蛋白,其中ETS1、HSP60、Bcl-2、C-myc、TIF1-β蛋白在宮頸鱗癌細胞表達明顯增高(P均＜0.05)。

3 討論

目前認為,宮頸癌的形成是一個涉及正常細胞生長改變和基因改變的復雜的多階段過程。本研究應用LCM和MALDI-TOF-MS技術(shù),對高同質(zhì)性宮頸鱗癌浸潤組織細胞及正常宮頸組織細胞進行蛋白質(zhì)組學的比較研究,成功鑒定出 5種差異蛋白,其中ETS1、HSP60、Bcl-2、C-myc、TIF1-β蛋白在宮頸鱗癌細胞表達明顯增高。ETS家族是一類轉(zhuǎn)錄因子,在組織的變異、淋巴組織的增生和血管生成等方面發(fā)揮作用。ETS發(fā)揮作用時與其聯(lián)合蛋白密切相關(guān)[3]。ETS-1蛋白的高表達可能與宮頸鱗癌的發(fā)生及浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。HSP60蛋白定位于宮頸癌細胞的胞質(zhì)中,在宮頸癌組織中過度表達[4],有可能成為宮頸癌早期診斷和治療的重要標志。C-myc癌基因?qū)俸说鞍谆?具有轉(zhuǎn)化細胞的能力,并具有與 DNA結(jié)合的特性,在調(diào)節(jié)細胞生長、分化及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用[5]。本研究表明,Bcl-2蛋白在宮頸鱗癌細胞高表達,而正常宮頸組織細胞低表達,表明Bcl-2基因與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。有報道[6],Bcl-2基因的過度表達并不影響細胞增殖,而是阻止細胞凋亡,使腫瘤細胞得以生存。本研究發(fā)現(xiàn),TIF1-β蛋白在宮頸鱗癌細胞中高表達。TIF1-β是一種轉(zhuǎn)錄中介因子,在諸多轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合體中起橋梁作用,參與形成具有組蛋白甲基化酶或組蛋白去乙?；富钚缘膹秃象w,通過中間的HP1BD區(qū)域與HP1蛋白相互作用,進而與組蛋白相結(jié)合[7]。

綜上所述,本研究采用LCM技術(shù)成功獲取了同質(zhì)宮頸癌細胞和正常宮頸細胞,發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌和正常宮頸細胞的2-DE蛋白質(zhì)圖譜具有明顯的差異表達,并成功鑒定出部分差異蛋白,該差異蛋白組可望作為宮頸鱗癌進展、轉(zhuǎn)移和預后的潛在預測指標及治療的分子靶點。

[1]Yim EK,Park JS.Role of proteomics in translational research in cervical cancer[J].Expert Rev Proteomics,2006,3(1)：21-36.

[2]Gutstein HB,Morris JS.Laser capture sampling and analytical issues in proteom ics[J].Expert Rev Proteom ics,2007,4(5)：627-637.

[3]Fujimoto J,Aoki I,Toyoki H,etal.Clinical implicationsof expression of ETS-1 related to angiogenesis in uterine cervical cancers[J]. Ann Oncol,2002,13(10)：1598-1604.

[4]Hwang YJ,Lee SP,Kim SY,et al.Expression of heat shock protein 60 kDa is upregulated in cervical cancer[J].Yonsei Med J, 2009,50(3)：399-406.

[5]Gao P,Tchernyshyov I,Chang TC,et al.C-myc suppression of miR-23a/b enhancesmitochondrial glutaminase expression and glutaminemetabolism[J].Nature,2009,458(7239)：762-765.

[6]Rughooputh S,Manraj S,Eddoo R,et al.Expression of the C-myc oncogene and the presence of HPV 18：possible surrogate markers for cervical cancer[J].Br JBiomed Sci,2009,66(2)：74-78.

[7]OkinoK,Nagai H,NakayamaH,etal.Inactivation ofCrk SH 3domain-binding guanine nucleotide-releasing factor(C3G)in cervical squamous cell carcinoma[J].Int JGynecol Cancer,2006,16(2)：763-771.