周 怡,王 琪,張 瑋,李 力,＊

(1廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,南寧 530021;2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)

激光捕獲纖維切割(LCM)技術(shù)可以根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)直觀、準(zhǔn)確和高效地從復(fù)合組織中特異性挑選出某一特定類型的細(xì)胞[1]。免疫磁珠(IMB)技術(shù)能使與磁珠上抗體特異性結(jié)合的抗原從其他物質(zhì)中分離出來,在免疫檢測(cè)、細(xì)胞分離、蛋白質(zhì)純化等方面均顯示出良好的應(yīng)用前景[2]。本研究采用 LCM聯(lián)合IMB技術(shù)釣取惡性卵巢上皮瘤細(xì)胞中的特異性標(biāo)志物黑色素瘤激活因子CXCL1及IL-8(1～77 aa)、IL-8(6～77 aa)和IL-8(9～77 aa),并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)技術(shù)進(jìn)行了檢測(cè)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 正常、良性及惡性卵巢上皮瘤組織為 2006～2008年廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院留取的手術(shù)標(biāo)本,經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)。惡性卵巢上皮瘤按照FIGO標(biāo)準(zhǔn)診斷為卵巢上皮癌,組織分級(jí)為 G2級(jí),臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期。

1.1.2 主要儀器及試劑 快速冰凍切片機(jī),激光捕獲微切割顯微鏡,基質(zhì)輔助激光解吸時(shí)間飛行質(zhì)譜。IMB試劑盒,微量層析柱,CXCL1、IL-8抗體。TBO染液,動(dòng)物細(xì)胞裂解液等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞捕獲及其蛋白的提取 正常、良性及惡性卵巢上皮瘤組織冰凍切片的制備、染色及脫水過程如文獻(xiàn)[3]所述。采用 LCM技術(shù),每張切片平均捕獲8 000 shottings。收集捕獲細(xì)胞,-80℃保存。用動(dòng)物細(xì)胞裂解液試劑盒提取捕獲細(xì)胞的總蛋白,按說明書操作。

1.2.2 CXCL1及不同亞型IL-8分離 采用IMB技術(shù)。操作按說明書進(jìn)行。

1.2.3 CXCL1及不同亞型IL-8蛋白樣本的濃縮和脫鹽 采用含C18填料的微量層析柱對(duì)CXCL1及不同亞型IL-8蛋白樣本進(jìn)行濃縮和脫鹽。

1.2.4 CXCL1及不同亞型IL-8的檢測(cè) 上述蛋白樣品酶切消化成肽段后,多肽的串聯(lián)質(zhì)譜鑒定用MALDI-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行。

2 結(jié)果

捕獲正常、良性及惡性卵巢上皮瘤細(xì)胞數(shù)分別為 1.32×106、1.40×106、1.28×106個(gè)。

M/Z為7 860的CXCL1在惡性卵巢上皮瘤細(xì)胞中表達(dá),且表達(dá)豐度較高(縱軸指示intense＞104),在良性卵巢瘤和正常卵巢上皮細(xì)胞中均不表達(dá)。

M/Z約為8 930的IL-8(1～77 aa)在惡性和良性卵巢瘤細(xì)胞中表達(dá),在正常卵巢細(xì)胞中不表達(dá); M/Z約為8 360的IL-8(6～77 aa)在惡性卵巢腫瘤細(xì)胞中表達(dá),在良性和正常樣本中不表達(dá);M/Z約為8 130的IL-8(9～77 aa)在卵巢惡性瘤細(xì)胞及良性或正常卵巢細(xì)胞中均不表達(dá)。另外,在經(jīng) IL-8 IMB獲取的卵巢上皮癌樣本中也發(fā)現(xiàn) M/Z約為7 860的CXCL1,可能與CXCL1和其他CXC族趨化因子如IL-8、NAP-2、ENA-78、PF-4等具有較高同源性有關(guān)。

3 討論

本課題組先期采用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)分析比較卵巢惡性腫瘤與正常婦女外周血中的蛋白質(zhì)譜表達(dá)差異,并構(gòu)建診斷模型,篩選確定對(duì)早期診斷卵巢癌有價(jià)值的外周血蛋白質(zhì)質(zhì)譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn) M/Z為 7 869、8 136、8 386和 8 927的蛋白對(duì)卵巢癌早期診斷具有重要意義。采用HPLC液相系統(tǒng)和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)上述蛋白質(zhì)予以純化鑒定,發(fā)現(xiàn)它們分別為黑色素瘤激活因子CXCL1和IL-8的不同亞型,即IL-8(1～77 aa)、IL-8 (6～77 aa)和IL-8(9～77 aa)[4]。之后,我們采用雙抗夾心ELASA法,應(yīng)用商業(yè)化的CXCL1和IL-8抗體,檢測(cè)其在 59例卵巢惡性腫瘤患者、64例卵巢良性腫瘤患者、142例健康婦女血清中的含量,結(jié)果顯示,CXCL1和IL-8在卵巢惡性腫瘤患者血清中的平均含量極顯著高于非惡性腫瘤人群(P＜0.01)。

Yang等[5]的研究認(rèn)為,CXCL1可被致癌基因Ras誘導(dǎo)產(chǎn)生,CXCL1依賴p53途徑誘導(dǎo)基質(zhì)纖維原細(xì)胞凋亡,而基質(zhì)纖維原細(xì)胞衰亡促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng),是正常卵巢上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤細(xì)胞的必要途徑。Dannenmann等[6]也在卵巢癌組織和快速增殖的卵巢癌細(xì)胞株中檢測(cè)到 CXCL1,進(jìn)一步證實(shí)CXCL1可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖。

由于蛋白質(zhì)水解酶剪接IL-8的N末端編碼氨基酸序列位置不同,形成 6種氨基酸序列長(zhǎng)度不同的IL-8亞型,其多肽序列分別為第 1～77、第5～77、第 6～77、第 7～77、第8～77、第 9～77氨基酸殘基,這些亞型都具有生物學(xué)活性,但不同亞型的 IL-8誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化和脫顆粒的能力是不同的[7]。采用質(zhì)譜技術(shù)則可以發(fā)現(xiàn)不同亞型IL-8在卵巢癌細(xì)胞或血清等中的差異。

本研究采用LCM、IMB聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù),有效地獲取了卵巢上皮癌細(xì)胞的特異標(biāo)志物CXCL1及不同亞型IL-8,并準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。我們將繼續(xù)深入研究CXCL1、不同亞型IL-8的定位及其在卵巢組織上皮細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量,并進(jìn)一步探討其在卵巢惡性腫瘤早期診斷中的價(jià)值。

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[4]王琪,李力,黎丹戎,等.應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片飛行質(zhì)譜技術(shù)篩選卵巢癌血清標(biāo)志物[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2006,5(8)：544-549.

[5]Yang G,Rosen DG,Zhang Z,etal.The chemokine growth-regulated oncogene 1(Gro-1)links RAS signaling to the senescence of stromal fibroblasts and ovarian tumorigenesis[J].PNAS,2006,103 (44)：16472-16477.

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