張小舟,鄒三明,馮華明,黃篤,康照利

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬孝感醫(yī)院,湖北孝感 432000)

節(jié)段性骨缺損的治療在臨床骨科領域存在很大的困難。我們采用自體外周血干細胞(autologous peripheral blood stem cell,APBSC)與表面脫鈣骨基質明膠 (bone matrix gelatin,BMG)共移植修復節(jié)段性骨缺損進行了臨床研究,在課題研究中進行了X線檢查,效果理想,達到了預期目的,在臨床有廣闊的應用前景,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2003年 12月至 2007年 12月我課題組共收治節(jié)段性骨缺損病例 36例(骨缺損長度選定為 6～12cm),男24例,女12例;平均年齡39歲(20～65歲)。其中,骨盆骨缺損3例,肱骨骨缺損9例,尺橈骨骨缺損 5例,股骨骨缺損 12例,脛腓骨骨缺損7例。骨腫瘤25例,骨折后骨不連 11例。

依據(jù)同種病情、患者自愿的原則,采用納入法將 36例患者隨機分為兩組(即 A組和 B組)。

1.2 APBSC的采集[1]及手術方法 患者入院后在常規(guī)術前檢查和治療原發(fā)病的基礎上,手術前6d給予分泌型重組人粒細胞刺激因子,600 μg/d皮下注射,連用5 d。手術當日經美國Baxter公司生產的 CS3000PLUS血細胞分離機,分離出外周血干細胞懸液 50mL,采集后干細胞不做任何處理留置備用(外周血干細胞采集工作在孝感市中心血站實驗室完成)。

根據(jù)患者骨缺損病變部位,采用相應的手術麻醉和手術切口,充分顯露骨缺損部位,徹底清理骨缺損部位的軟組織和病變骨組織。疏通上下髓腔,將骨斷端修理成梯形以便充分嵌合,清洗術野。

根據(jù)骨缺損長度制備相應的 BM G(課題組所用 BM G均由醫(yī)院指定的山西組織骨庫制備、提供),將外周血干細胞懸液種入制備好的BMG中。A組患者將APBSC/BM G復合體充分嵌合于骨斷端,B組患者僅使用 BMG嵌合于骨斷端,根據(jù)骨缺損部位選擇相應的鋼板、螺釘或交鎖髓內釘進行牢固內固定。

術野放置引流管,依次縫合各層組織,術畢。術后24h拔引流管,抗生素術后使用1周,術后 2周切口拆線。

2 結 果

2.1 影像學觀察 術后1個月復查X線片顯示：A組患者骨折端有骨痂形成;B組患者骨折端骨痂形成不明顯,兩組患者骨折處皆有壓痛。2個月復查X線片顯示：A組患者可見骨折端有大量骨痂形成,骨折處壓痛不明顯,此時開始功能鍛煉;B組患者骨折端有骨痂形成,骨折處壓痛較前減輕。3個月復查 X線片顯示：A組患者可見骨折端有連續(xù)骨痂形成,骨折處無壓痛;B組患者骨折端有大量骨痂形成,骨折處有輕微壓痛。

2.2 愈合時間比較 平均愈合時間 A組為 5個月,B組為 8個月,兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在治療期間,患者未見感染及其他并發(fā)癥,隨訪12個月均未發(fā)生再骨折。

2.3 功能評估 術后結果評定根據(jù)國際保肢學會功能評分標準[2]評定 ,術后依疼痛程度、功能活動、心理接受程度、是否用外部支持、行走能力和步態(tài)6個指標評價效果。每個指標分0、1、2、3、4、5分,共6級?？偡?0分,大于 24分為優(yōu),18～24分為良,小于15分為差。A組優(yōu) 16例,良 2例;B組優(yōu)14例,良4例,兩組間差異沒有統(tǒng)計學意義。

3 討 論

3.1 APBSC/BM G移植理論基礎 骨組織的再生要求有 3個基本的生物學因素參與,即細胞,生長調節(jié)因子,細胞外支架材料。種子細胞(成骨細胞)：理想的骨組織工程種子細胞應具備下列特點,即取材容易,對機體損傷小;在體外培養(yǎng)中易定向分化為成骨細胞和具有較強的傳代繁殖能力;植入機體后能適應受區(qū)的環(huán)境并保持成骨的活性。目前發(fā)現(xiàn)種子細胞有以下幾種來源,即胚胎骨、骨外膜、骨髓、骨外組織(包括外周血干細胞)。其中,外周血干細胞具有很強的傳代繁殖和定向分化為成骨細胞的能力,植入機體后能適應受區(qū)的環(huán)境,保持成骨活性。生長調節(jié)因子：主要是生長因子和細胞因子,在組織工程中,某些種子細胞在體外傳代培養(yǎng)后,經過一段時間細胞極易衰老,而生長因子能調節(jié)種子細胞的增殖和分化。對成骨細胞起著重要調節(jié)作用的生長因子有轉化生長因子β、胰島素樣生長因子、骨形成蛋白、堿性成纖維細胞生長因子及血小板衍生生長因子等。細胞外支架材料：理想的組織細胞外基質材料必須具有如下特征,即良好的生物相容性,良好的生物降解性,具有三維立體多孔結構,良好的可塑性和一定的機械強度,良好的材料-細胞界面,材料須易于消毒。用于組織工程的支架材料有天然和人工合成兩類,目前用于細胞支架材料的主要有聚乳酸、聚羥基乙酸及表面脫鈣骨基質明膠。它們突出的優(yōu)點是：生物相容性良好,降解速度可調,降解產物易于代謝和排除,以及材料易于消毒等。

干細胞又稱為多潛能干細胞,主要來源于胚胎時期的卵黃囊,為骨髓的原始細胞。既往用于移植的干細胞主要采自骨髓,因此稱為骨髓移植。然而隨著血液學研究的進一步深入,有研究發(fā)現(xiàn)[3]干細胞不僅存在骨髓中,同時也存在于臍帶血、胚胎肝臟及外周血中,骨髓移植這一較為片面的概念逐漸被干細胞移植所替代。APBSC來源于骨髓,與骨髓干細胞具有共同的生物學特征,既不斷地自我更新,在造血組織中維持一定數(shù)量的能力,又有分化為骨髓紅細胞系、粒細胞系、淋巴細胞系以及巨核細胞系的潛力[4]。有研究表明[5]外周血細胞的不同階段,包括干細胞、前祖細胞及晚祖細胞,均有 CD34+細胞膜分化抗原,然而定向祖細胞卻沒有這種抗原,由此外周血干細胞可以由 CD34+細胞代表。正常情況下,外周血細胞中只有(0.2±0.1)%的 CD34+細胞[6],表明外周血中干細胞數(shù)量極低,遠不能滿足臨床應用的需要。增加移植所需要外周血干細胞數(shù)的主要方法包括[1]：a)骨髓抑制性化療藥;b)造血因子：其中粒細胞集落刺激因子最常用; c)前兩種聯(lián)合應用,以上方法可使外周血干細胞增加數(shù)十倍,甚至數(shù)百倍。本課題組根據(jù)課題研究條件選擇粒細胞集落刺激因子進行骨髓動員。目前從外周循環(huán)血中直接分離外周血干細胞的難度較高,本實驗利用干細胞的大小與淋巴細胞接近的形態(tài)學特點,用淋巴細胞分離液從外周血中分離淋巴細胞或單個核細胞,從而提取移植所需要的外周血干細胞[5,7]。

Chalmers等[8]提出骨形態(tài)蛋白、間充質細胞、骨生長環(huán)境是誘導成骨的三個關鍵要素,骨形態(tài)蛋白作為誘導刺激物作用于間充質細胞,在有利于骨生長的血液環(huán)境中,誘導刺激骨形成。 BM G含有骨形態(tài)蛋白,其由同種異體骨經過脫脂、表面脫鈣、脫蛋白、脫細胞處理等處理后,去掉了除骨形態(tài)蛋白以外 95%的非膠原蛋白和具有阻滯作用的脂質成分[9]。有實驗研究表明[10],BM G移植在短期(6～9周 )可以產生較大的骨誘導作用。BM G[11]的特點：既有強度又有孔隙;其免疫原性低,生物相容性好;與外周血干細胞及軟骨細胞復合后具有較好的兼容性;能在體內逐漸吸收,被新骨所替代;來源廣泛。因此,逐漸成為臨床上常用的骨移植材料[12,13]。 BM G不用與任何移植材料的空白對照組比較,其療效已被大量文獻報告[14-16]所肯定。

骨折愈合是建立骨的連續(xù)性和恢復骨的生物學特性。APBSC/BMG復合移植治療骨缺損,既利用了外周循環(huán)血中的多潛能干細胞,保留骨的生物學特性;又利用了 BM G中的骨形態(tài)蛋白,從而誘導成骨細胞形成[17,18]。APBSC在 BM G的骨形態(tài)蛋白誘導下具有明顯的成骨作用。與單純 BM G移植相比較,APBSC/BM G復合移植具有新骨形成時間更短、新骨形成質量更好的優(yōu)點。

我們認為 APBSC/BMG復合移植具有廣泛的臨床應用前景,理由是：a)APBSC/BM G復合移植避免了傳統(tǒng)手術中自體采骨給患者帶來的痛苦以及供區(qū)新的骨缺損等一系列并發(fā)癥,對機體創(chuàng)傷減小到最低限度,移植物處理達到幾乎無創(chuàng)傷[14]。b)使骨缺損修復的手術難度降低。c)與同種異體骨或異種骨移植相比較,免疫排斥反應極小;與人工骨比較, BMG同時具有良好的生物相容性、生物降解性能,在體內吸收被新骨所替代[16,19]。d)BM G可塑形,APBSC/BMG復合移植不僅在骨科,還可廣泛應用于頜面外科及整形外科。

3.2 異體骨的應用及內固定的選擇 自體骨移植是臨床常用的修復骨缺損的方法。自體骨移植無免疫排斥反應,骨誘導作用好。若受床血供良好,有健康的軟組織覆蓋,則骨愈合快,效果令人滿意。但骨源有限,并且會對供體造成新的缺損,而且人工替代物尚不適用于大段骨移植[20]。同種異體骨移植已有百年歷史,近年骨庫的發(fā)展使供體的選擇、制備、滅菌和保存方法更加規(guī)范、嚴格。異體骨植骨量充足,形態(tài)可按需選擇。另外,本組病例中我們采用了鋼板、螺釘和牢固的絞鎖髓內釘內固定,這些固定對于早期的異體骨愈合能起到較好作用。

3.3 骨缺損長度的選擇 課題組選擇的病例骨缺損長度為6～12 cm,因為骨缺損在6cm以下可以通過截取自體髂骨填充缺損段達到較好骨愈合;對于12cm以上的缺損,血管化植骨優(yōu)于游離植骨。所以兩組病例我們都選擇骨缺損長度為 6～12 cm具有可比性[21]。

3.4 APBSC/BMG臨床應用前景 APBSC/BM G具有諸多優(yōu)點,如 APBSC/BM G復合移植對機體的創(chuàng)傷大大減少,避免了傳統(tǒng)手術中取自體骨給患者帶來的巨大痛苦,也可減少供區(qū)產生新的骨缺損等一系列并發(fā)癥;此方法使治療骨缺損的難度降低;APBSC/BM G免疫排斥反應小,具有較好的生物相容性,可在體內吸收被新骨所取代;與商品化的人工骨相比,APBSC/BM G所需費用不高;另外,BMG具有可塑性,APBSC/BM G也可廣泛應用于整形外科等領域。因此APBSC/BMG復合移植具有廣泛的臨床應用前景。

3.5 并發(fā)癥 a)應用大塊同種異體骨移植后的最主要并發(fā)癥是排異反應繼發(fā)的感染、骨不連、異體骨骨折等。本組 36例未見嚴重的排異反應繼發(fā)的感染、骨不連、異體骨骨折。這種現(xiàn)象應與良好的固定保證了移植區(qū)域的穩(wěn)定有關。b)在外周血干細胞動員時觀察有無骨痛、乏力、皮疹、發(fā)熱、胃腸道反應(惡心、嘔吐、便秘)。c)在外周血干細胞分離及采集過程中觀察有無低鈣性口周麻木、抽搐,迷走神經反應性面色蒼白,低血容量性面色蒼白、暈厥[22]。d)腫瘤患者 APBSC移植后腫瘤可能復發(fā)。

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