哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（150001）宋烜赫 楊衛(wèi)良

骨缺損引起的相關(guān)疾病是嚴(yán)重影響人生活質(zhì)量和社會勞動力的常見病。長期以來，骨缺損修復(fù)都屬于重要的研究課題，迄今為止，臨床對創(chuàng)傷、感染和腫瘤切除后所造成的大范圍骨缺損的修復(fù)仍未得到有效的解決。人們嘗試過很多治療方法，但均存在一定的問題和缺陷。如自體骨的移植，其來源有限且對機體產(chǎn)生新的創(chuàng)傷，在臨床中很難實現(xiàn)，意義不大；異體骨移植存在免疫排斥反應(yīng)，影響治療效果；一般的人工合成替代物植入后常會引起感染、假體松動及異物反應(yīng)等并發(fā)癥。有材料表明，間充質(zhì)干細(xì)胞的抗原性較弱[1]，如能以同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞與組織工程材料相結(jié)合，在體內(nèi)及體外誘導(dǎo)生成骨組織，將為骨缺損的治療開辟一個嶄新的領(lǐng)域。間充質(zhì)干細(xì)胞是具有多向分化功能的細(xì)胞，其在成體細(xì)胞中含量極少，但可以通過分離提純及擴增培養(yǎng)大量獲得，并在定向誘導(dǎo)劑的作用下向成骨方向轉(zhuǎn)化。本實驗鑒于上述情況開展了間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)并治療骨缺損研究，希望能找到新的更合適的骨源，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行自擬中藥復(fù)方益骨湯對骨缺損輔助治療作用的探討。

1 材料和方法

1.1 MSCs的分離培養(yǎng) 選取雄性大白兔，體重為2.5kg±500g。用含肝素30u/ml的注射器于股骨粗隆抽取骨髓2ml加入含10%胎牛血清和青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（Gibsco公司）中，吹打混勻，置培養(yǎng)瓶中，37℃、5%C02、95%相對濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。5d后半量換液，1周后全部換液，以后每周換液2次，逐步去除未貼壁細(xì)胞。14d后貼壁細(xì)胞匯合到90%生長面積時，用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，取第2代MSCs備用。

1.2 MSCs纖維蛋白復(fù)合物的制備 取第2代細(xì)胞計數(shù)后制成5.0×106/ml的細(xì)胞懸液，按1∶1與纖維蛋白（醫(yī)用安可膠）混合，置12孔培養(yǎng)板、37℃孵育箱內(nèi)聚合1h，收縮過夜后備用。用條件培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導(dǎo)3天，誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化。

1.3 骨缺損模型的制作及處理 選用4～5個月齡清潔級雄性日本大耳兔20只（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物中心提供），重2.5kg±500g。3%戊巴比妥30 mg/kg耳緣靜脈麻醉，取膝關(guān)節(jié)外側(cè)切口顯露股骨髁, 用手鉆在股骨髁外側(cè)寬大處制作0.6cm×1.0cm的松質(zhì)骨缺損。沖洗干凈骨屑后，將同種異體MSCs復(fù)合物植入大白兔股骨缺損處。實驗組用益骨湯灌胃，按照人/兔體表面積換算服藥量，1次/d，對照組采用相同方法以蒸餾水替代中藥湯劑。術(shù)后不固定肢體，分籠飼養(yǎng)，連續(xù)3 d使用青霉素預(yù)防感染。

1.4 術(shù)后觀察 觀察動物的進(jìn)食、活動和切口愈合情況。分別于術(shù)后8、12、16、24周進(jìn)行骨密度測定及鏡下組織觀察，以了解骨缺損的修復(fù)。各期用空氣栓塞法處死動物5只，大體觀察缺損區(qū)修復(fù)情況，切取股骨標(biāo)本，用10%中性福爾馬林溶液固定，脫鈣切片后HE染色，光鏡下觀察新生骨痂和骨缺損愈合情況。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)情況 骨髓用淋巴細(xì)胞分離液分離出的細(xì)胞為較單一的圓球形細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，見原代細(xì)胞培養(yǎng)24小時后大部分細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞逐漸從圓球形變成短梭形、長梭形，形態(tài)飽滿。72小時后貼壁細(xì)胞分裂增殖明顯，并逐漸形成細(xì)胞團(tuán)、集落。以后集落不斷增大，相互匯合，約12d后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底。有些不貼壁的細(xì)胞，呈圓形，大部分隨換液除去。傳代約4小時后細(xì)胞開始貼壁，貼壁細(xì)胞呈梭形、多角形，傳代后細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，但增殖速度加快。

2.2 ALP測定結(jié)果 細(xì)胞經(jīng)條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)后，ALP活性明顯增高，3天后實驗組即明顯高于對照組，隨后實驗組逐漸升高，8天左右達(dá)到高峰，其后稍有下降，但仍高于對照組。ALP測定結(jié)果提示經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞具有較強堿性磷酸酶活性。2.3 放射學(xué)檢查 實驗組：術(shù)后第8周骨缺損區(qū)兩斷端有少量骨痂形成；術(shù)后第12周骨缺損區(qū)兩斷端有大量模糊骨痂形成；術(shù)后第16周骨缺損區(qū)新骨密度增高，部分骨皮質(zhì)連續(xù)；術(shù)后第24周骨缺損區(qū)新骨塑形好，骨皮質(zhì)連續(xù)，新骨髓腔較通暢。對照組：術(shù)后第8周骨缺損區(qū)無明顯變化；術(shù)后第12周缺損區(qū)骨兩斷端出現(xiàn)少量骨痂陰影；術(shù)后第16周缺損區(qū)有模糊骨痂生長，骨痂向移植物長入；術(shù)后第24周缺損區(qū)骨痂生長逐漸增多，兩斷端連接不完全，新骨再生塑形差，髓腔未再通。

3 討論

MSCs是一種可以分化為多種中胚層細(xì)胞的成體干細(xì)胞，有證據(jù)表明MSCs具有體外成鈣、體內(nèi)成骨的能力。近年基于此的組織工程取得了諸多進(jìn)展，主要表現(xiàn)在以自體骨髓MSCs為種子細(xì)胞復(fù)合不同載體修復(fù)各類骨缺損的實驗研究和初步的臨床應(yīng)用。但自體MSCs的回植須經(jīng)歷抽取骨髓、培養(yǎng)擴增及質(zhì)量控制檢測等階段[2]，并且自體骨髓MSCs的增殖、成骨分化能力隨著年齡的增加而減弱[3]，不適合臨床應(yīng)用。

Arinzen等[2]使用同種異體MSCs復(fù)合羥基磷灰石-磷酸三鈣成功修復(fù)了狗股骨的節(jié)段性骨缺損，并指出其修復(fù)效果與自體MSCs相似，明顯優(yōu)于無細(xì)胞植入組。骨缺損的研究多采用皮質(zhì)骨節(jié)段性骨缺損為模型，但也有研究員指出兔股骨髁0.6 cm×1.2 cm的松質(zhì)骨缺損不能自行愈合[4]。本實驗也支持這種觀點，兔股骨髁的松質(zhì)骨缺損模型是可行的。

國內(nèi)外的許多學(xué)者也嘗試了中藥在骨折愈合中的作用并進(jìn)行了大量的研究[5～8]。周重建[9]發(fā)現(xiàn)，使用益氣化癖中藥能促進(jìn)骨折斷端及其周圍毛細(xì)血管的開放量，而且多核巨噬細(xì)胞活性明顯增強。林燕萍也報道[10]，服用煅狗骨后骨折處的血腫吸收和機化明顯快于對照組，認(rèn)為煅狗骨具有活血通絡(luò)、健脾生肌的效應(yīng)。另有學(xué)者[11][12]發(fā)現(xiàn)，肢傷三方（續(xù)斷、當(dāng)歸、白芍、土鱉等）具有刺激大白兔骨折局部新生毛細(xì)血管網(wǎng)的形成，改善骨折局部的血液循環(huán)，加快新陳代謝，強有力地刺激成骨細(xì)胞的活性。同時在骨折愈合處I型膠原表達(dá)增強。林潤臺[13]通過對骨折愈合過程中超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，用丹參后成纖維細(xì)胞核仁有著邊、核凹陷的現(xiàn)象，特別是形成膠原的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量增加。由此推測成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)合成旺盛，有利于產(chǎn)生更多的膠原纖維，促進(jìn)骨折愈合。

本實驗應(yīng)用益骨湯，其藥物組成為骨碎補、丹參、川牛膝、枸杞子、山藥、炒山楂、薄荷和陳皮。其中，骨碎補，味苦，性溫，入肝、腎經(jīng)，功用補腎強骨，活血止血，續(xù)傷止痛，不但可治療腎陽不足之骨萎肉卻而治本，亦可活血通絡(luò)而治病之標(biāo)。川牛膝，味苦、酸，性平，歸肝、腎經(jīng)，功用活血通經(jīng)、引血下行、補肝腎、強筋骨、利水通淋。川牛膝之于治療骨蝕，亦屬于既能補遺強壯、又能活血通利的標(biāo)本同治之品。枸杞子，味甘質(zhì)潤而性平，功用滋補肝腎、益精養(yǎng)血，長于治療腎精肝血不足所致髓枯骨殘。骨碎補和枸杞子，一療腎之元陽不足而冷痹骨萎，一療腎之陰精不充而髓枯骨萎，二者相互配合，共同切中腎虛骨萎的核心病機。丹參，味苦而性微寒，可活血通痹。《別錄》稱其主“腰脊強、腳痹”，亦以清通氣血之功，而能除血瘀血熱、宣絡(luò)蠲痹，治療骨節(jié)疼痛、四肢不遂，亦可助諸般補益肝腎之品達(dá)于病所，而收治療骨萎之功。山藥，味甘，性平，歸脾、肺、腎經(jīng)，功用益氣養(yǎng)陰、補脾肺腎。其具備的補中益氣而溫養(yǎng)肌肉與益腎固精而療腎虛腰痛的雙重功效，使其成為治療骨萎之證所必須。陳皮，味苦辛而性溫，歸脾、肺經(jīng)，可理氣健脾、祛濕消痰。蓋脾氣健運，氣機調(diào)暢，經(jīng)絡(luò)痰濕得消，則可助精微消化、吸收、布散以調(diào)治骨萎。炒山揸，味酸、甘，性微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，功效消食化積、行氣散瘀，亦可助精微消化、吸收、布散以調(diào)治骨萎。薄荷，味辛，性涼，歸肺、肝經(jīng)，其力能內(nèi)透筋骨、外達(dá)肌表、宣通臟腑、貫串經(jīng)絡(luò)。故對于肝失調(diào)達(dá)、肝氣郁結(jié)所致之氣血阻滯、骨髓脈絡(luò)失養(yǎng)之病機，以薄荷最宜。

在中藥對于細(xì)胞及生長因子的調(diào)節(jié)機制研究中，林燕萍[10][14][15]等發(fā)現(xiàn)，煅狗骨促進(jìn)垂體TSH細(xì)胞功能的同時也促進(jìn)OH細(xì)胞功能，促進(jìn)甲狀腺素的分泌，并認(rèn)為鍛狗骨可能通過甲狀腺激素和生長激素的直接或間接作用，刺激骨折斷端的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)新生骨小梁的形成，最終促進(jìn)骨折的愈合。劉獻(xiàn)祥[15]用免疫組化技術(shù)進(jìn)行圖像定量分析的結(jié)果表明，中藥（補腎復(fù)方）能明顯提高骨折模型家兔骨折處骨癡DNA指數(shù)和BMP含量，促進(jìn)和誘導(dǎo)BMP的合成，加速骨折愈合。

本實驗相同時期實驗組與對照組相比有明顯改變：①中藥治療組明顯促進(jìn)和縮短骨缺損修復(fù)時間；②使用中藥治療后血腫吸收和機化時間明顯縮短；③服用中藥期間，間充質(zhì)細(xì)胞呈梭形改變明顯，骨核細(xì)胞濃縮，染色質(zhì)凝聚靠邊，有大量的膠原纖維，細(xì)胞質(zhì)容量的增加，特別是形成膠原纖維的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量增加。結(jié)果表明，同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)輔以中藥益骨湯治療骨缺損，不但能有效縮短病程，提高患者生活質(zhì)量，減輕患者痛苦，而且中醫(yī)的辨證論治方法可以實現(xiàn)真正的個體化治療，即針對不同人群的不同體質(zhì)骨破損后產(chǎn)生的不同癥狀遣方用藥，避免了重復(fù)用藥的弊端。此外，中藥制劑方便易尋，價格低廉，便于推廣應(yīng)用。