劉 川綜述，寧 安審校

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院；2、江西省寄生蟲研究所 330006)

1 概述

人類白細(xì)胞抗原(HLA)基因位于第6號(hào)染色體短臂6P21.3區(qū)，是已知人類基因組中基因最豐富的一個(gè)區(qū)域，至少包括239個(gè)基因座[1]。HLA分型已用于組織配型，器官移植、疾病相關(guān)性研究、人類學(xué)和法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。HLA分型過去主要采用血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法，隨著PCR技術(shù)，基因芯片技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已建立了從DNA水平上進(jìn)行分型的HLA基因分型技術(shù)。我們對近年來出現(xiàn)的幾種HLA基因分型方法作一概述。

2 方法

2.1 PCR-SSOP(序列特異性寡核苷酸探針)

PCR-SSOP是以核酸雜交為基礎(chǔ)的分型技術(shù)。其原理是：先對HLA的多態(tài)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，在擴(kuò)增過程中對PCR產(chǎn)物進(jìn)行同位素或非同位素標(biāo)記，然后針對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)堿基配對原則設(shè)計(jì)系列寡核苷酸探針固定在膜上，最后將PCR產(chǎn)物與膜上的探針雜交、放射自顯影根據(jù)信號(hào)判斷結(jié)果。該方法靈敏度非常高，1個(gè)堿基的差異都能被檢測出來[2]。

PCR-SSOP技術(shù)用于HLA分型主要包括正相SSOP方法和反相 SSOP方法兩種。前者是將PCR產(chǎn)物固定在膜上，用標(biāo)記的探針與之進(jìn)行雜交，后者是將特異性探針固定在膜上， 用標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與之雜交[3]。目前廣泛采用的是反相 SSOP方法。它特別適合于大批量實(shí)驗(yàn)，如在臍血庫和骨髓庫HLA分型中作為首選的方法。與傳統(tǒng)方法相比較，PCRSSOP法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、需樣品量少等優(yōu)點(diǎn)。它不象電泳技術(shù)那樣，在鑒定不同系列凝膠中DNA片段的精確大小時(shí)，存在誤差等問題，因此可用于其它技術(shù)不易分辨的等位基因的檢測及位點(diǎn)的鑒定。到目前為止。各國學(xué)者設(shè)計(jì)的探針，可用于檢測幾乎所有目前所知HLA等位基因。

2.2 PCR-RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)

九十年代初隨著PCR方法與之結(jié)合，該方法得到普遍推廣。其原理是：HLA特異等位基因內(nèi)部存在多個(gè)核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，由于不同的HLA特異等位基因之間存在著核苷酸的差異，用相同的限制性核酸內(nèi)切酶去消化這些特異性等位基因的差異位點(diǎn)，會(huì)得到不同長度、不同數(shù)目的DNA片段。經(jīng)電泳，溴乙錠染色，紫外照射成像后借助HLA分型程序或手工查表即可確定HLA基因型別。鄔于川[4]等應(yīng)用PCR-RFLP方法進(jìn)行了HLA-DPB1等位基因與四川漢族人哮喘的相關(guān)性研究。

PCR-RFLP法準(zhǔn)確性好，但選擇怎樣的核酸內(nèi)切酶來消化和區(qū)分所有等位基因是該技術(shù)的關(guān)鍵問題?，F(xiàn)可通過計(jì)算機(jī)軟件輔助解決該問題，但是如果等位基因PCR擴(kuò)增片段中只有1～2個(gè)核苷酸差別時(shí)，可能找不到能對它們加以區(qū)分的特異的限制性核酸內(nèi)切酶，需做PCR-SSCP補(bǔ)充區(qū)分。而且有時(shí)由于實(shí)驗(yàn)條件等原因,擴(kuò)增產(chǎn)物有不被內(nèi)切酶消化切割的可能。PCR-PFLP由于其技術(shù)復(fù)雜與HLA本身高度多態(tài)性，其限制性片段格局表現(xiàn)異常復(fù)雜,使其在HLA研究領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用受到一定程度的限制。

2.3 PCR-SSP(序列特異性引物)

根據(jù)HLA各型別核苷酸堿基序列差異性，設(shè)計(jì)出一系列特異性引物。因Taq DNA聚合酶沒有3′→5′核酸內(nèi)切酶活性，引物3′端最后一個(gè)堿基是否與模板配對決定著能否擴(kuò)增出產(chǎn)物。若將引物的3′端最后一個(gè)堿基設(shè)計(jì)在各特異性之間正好有差異的那個(gè)堿基序列上，則擴(kuò)增產(chǎn)物僅需常規(guī)瓊脂糖電泳，根據(jù)特異產(chǎn)物存在與否即可直接對HLA基因進(jìn)行型。該方法關(guān)鍵是特異引物的設(shè)計(jì)與PCR體系的準(zhǔn)確無誤?？赏ㄟ^提高退火溫度，加入內(nèi)源性陽性對照等措施確保產(chǎn)物的特異性和反應(yīng)體系的特異性。黃飛[5]等進(jìn)行PCR-SSP/PCR-SBT-HLA高分辨等位基因分型比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法具有實(shí)驗(yàn)互補(bǔ)意義。若同時(shí)應(yīng)用兩種方法能夠有效改善HLA等位基因高分辨分型的準(zhǔn)確性和重復(fù)一致率。

PCR-SSP與 PCR-SSOP，PCR-RFLP 相比較，具有以下特點(diǎn)：(1)高度特異性：針對各等位基因順序設(shè)計(jì)的引物，從PCR第一個(gè)循環(huán)開始就是特異性擴(kuò)增，提高退火溫度又加強(qiáng)了這種特異性。(2)簡便而迅速地結(jié)果判斷。(3)高度分辨率：每對引物對特定順序片段進(jìn)行百萬倍以上的擴(kuò)增,產(chǎn)物分辨率高。但是用PCR-SSP法由于涉及多對引物進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)成本高，而且由于特異引物的有限性，有些罕見的HLA-DR特異性難以用此方法檢出。

2.4 PCR-SNP(單核苷酸多態(tài)性)

單核苷酸多態(tài)性是人類基因組中存在的以每1000個(gè)堿基出現(xiàn)1～10個(gè)穩(wěn)定遺傳雙等位基因的單堿基對差異，它可能是人類基因表達(dá)和蛋白活動(dòng)中的一個(gè)功能性成分。目前已在HLA-I類基因內(nèi)以400bp一個(gè)SNP的密度發(fā)現(xiàn) 了大量的SNP，這為高通量主要組織相容性復(fù)合物 (MHC)-SNP檢測奠定了基礎(chǔ)，該技術(shù)較其它技術(shù)節(jié)省時(shí)間和費(fèi)用。隨著第3代遺傳標(biāo)記SNP的發(fā)展，有望在HLA復(fù)合體中尋找到一系列SNP位點(diǎn)，并繪制其高密度SNP圖譜，進(jìn)一步研制MHC-SNP試劑盒以對HLA進(jìn)行分型。

因此，第13屆IHWC提出了制作HLA區(qū)域內(nèi)高密度SNP圖，研發(fā)HLA-SNP分型試劑盒，使SNP技術(shù)成為一種簡易有效的HLA分型方法的目標(biāo)。2.5 SBT(直接測序分型)

SBT原理是：首先用 PCR擴(kuò)增獲得DNA片段，然后采用測序反應(yīng)獲得擴(kuò)增片段的堿基序列。由于獲得了擴(kuò)增片斷的全部堿基序列，故該方法是最可靠也最徹底的基因分型方法，它不僅能進(jìn)行序列識(shí)別和分型，更有助于發(fā)現(xiàn)新的基因型，目前只有通過測序才可準(zhǔn)確證實(shí)新發(fā)現(xiàn)的HLA等位基因。已有報(bào)道，血清學(xué)結(jié)果為空白或PCR-SSP和PCR-SSOP未能檢出或幾種分型結(jié)果不一致時(shí)，均可通過SBT技術(shù)獲得準(zhǔn)確、可靠的高分辨結(jié)果[6]。Hurley[7]等采用PCR-SBT法對美國NMDP 1775名骨髓移植患者和無關(guān)供者作HLA等位基因分型，分析HLA-A，HLA-B，HLA-DR抗原匹配情況發(fā)現(xiàn)，骨髓移植病人和供者間HLA等位基因的不匹配情況遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出預(yù)想。

SBT之所以優(yōu)于PCR-SSP和PCR-SSOP，主要在于它能分析包括非多態(tài)性位點(diǎn)在內(nèi)的整個(gè)基因組序列。且SBT不但可以對DNA測序，也可對cDNA測序來分析基因的表達(dá)。隨著DNA測序技術(shù)的普及，該方法越來越受到重視。PCR-SBT法無論在分型精確度、工作效率還是自動(dòng)化程度都明顯優(yōu)于其他幾種分型方法，目前已有專門的HLA分型軟件與自動(dòng)上樣的固相測序試劑盒，而且測序費(fèi)用大大降低。因此，PCR-SBT法是科研工作中最理想的HLA分型方法，隨著自動(dòng)核酸測序成本的降低，這一分型技術(shù)將被廣泛應(yīng)用[8]。

2.6 基因芯片或DNA微陣列技術(shù)

基因芯片技術(shù)由美國Affymetrix公司首先開發(fā)。短短數(shù)年中，芯片技術(shù)進(jìn)展迅速。其原理為反向斑點(diǎn)雜交，即通過點(diǎn)樣儀將成千上萬個(gè)代表不同基因的寡核苷酸探針點(diǎn)樣于固相支持物表面，這些探針可與放射性標(biāo)記物或熒光素標(biāo)記的樣品DNA或cDNA互補(bǔ)核酸序列相結(jié)合，通過放射自顯影或熒光檢測，雜交結(jié)果通過計(jì)算機(jī)軟件處理分析后獲得雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布模式圖，從而反映樣品中基因表達(dá)的情況。

與現(xiàn)有的分型技術(shù)比較，基因芯片分型有如下優(yōu)勢：①具有集成化的優(yōu)點(diǎn)；②操作非常簡便：結(jié)果判讀通過熒光掃描，而不是凝膠電泳，大大簡化了操作，縮短了時(shí)間；③靈敏度高：芯片通過2級(jí)放大，第1級(jí)是在PCR擴(kuò)增模板D NA時(shí)，第2級(jí)是在讀取雜交結(jié)果時(shí)熒光素的2級(jí)放大，大大提高了靈敏度；④效率高：只需要1張芯片，1次PCR，1次雜交就可以對多個(gè)樣本進(jìn)行 HLA-A、B、D R、DQ等位點(diǎn)DNA分型；⑤標(biāo)準(zhǔn)化程度高：采用多種、多點(diǎn)、同步雜交法檢測靶基因和自動(dòng)化分析結(jié)果，可確保檢測特異性和客觀性，最大限度減少人為誤差；⑥成本較低：由于芯片制作和檢測的自動(dòng)化程度較高，并且固定在芯片上探針量和PCR所用的樣本量很小，芯片可以實(shí)現(xiàn)單片多人用，由此使檢測的成本降低。這些會(huì)促使HLA基因芯片分型技術(shù)在臨床上得到廣泛應(yīng)用[9]。但是，目前基因芯片還存在著儀器設(shè)備昂貴，方法有待標(biāo)準(zhǔn)化以及信號(hào)檢測低等不足，相信這些問題很快就會(huì)得到解決，一旦這種高效的分型方法用于臨床 必然會(huì) 帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。

3 展望

上面談及的幾種基因水平上HLA分型方法，是近年來國內(nèi)外研究得較多的。各種HLA基因分型方法各有優(yōu)勢，不能相互替代。例如PCR-SSP操作簡單、快速，但要進(jìn)行高分辨基因分型，就需要設(shè)計(jì)大量的序列特異性引物，使整個(gè)實(shí)驗(yàn)變得十分昂貴，而且操作流程延長。PCR-SSOP進(jìn)行高分辨基因分型時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)價(jià)格昂貴，流程復(fù)雜的問題 ，故大有被基因芯片所取代的趨勢。芯片自動(dòng)化程度較高，所需探針量和PCR所用樣本量很小，芯片可以實(shí)現(xiàn)單片多人使用，由此使檢測的成本降低。但由于儀器昂貴，在一定程度上制約了其推廣和應(yīng)用。PCRSNP技術(shù)簡單、快捷、分辨率高，隨著其技術(shù)的不斷改進(jìn),有望成為最為普及的HLA分型方法。SBT是一種分辨率最高、最可靠的分型方法，但由于其價(jià)格昂貴,限制其普及使用。為此，不同科研與醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)各自的條件、要求和目的而選用合適的方法。就臨床組織器官移植而言，采用中分辨度DNA分型技術(shù)是最佳選擇，劉川[10]等應(yīng)用PCR-SSP方法進(jìn)行了造血干細(xì)胞移植的HLA分型，獲得了準(zhǔn)確的結(jié)果。就科研工作而言，一般采用高分辨率分型方法。隨著各學(xué)科之間的滲透與交叉，加強(qiáng)HLA基因分型方法的標(biāo)準(zhǔn)化，使分型向最快最準(zhǔn)確的方向發(fā)展，將有助于推動(dòng)HLA的相關(guān)研究和各領(lǐng)域研究成果的相互借鑒[11]。

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