劉 川綜述，寧 安審校

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院；2、江西省寄生蟲研究所 330006)

1 概述

人類白細胞抗原(HLA)基因位于第6號染色體短臂6P21.3區(qū)，是已知人類基因組中基因最豐富的一個區(qū)域，至少包括239個基因座[1]。HLA分型已用于組織配型，器官移植、疾病相關(guān)性研究、人類學(xué)和法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。HLA分型過去主要采用血清學(xué)和細胞學(xué)方法，隨著PCR技術(shù)，基因芯片技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已建立了從DNA水平上進行分型的HLA基因分型技術(shù)。我們對近年來出現(xiàn)的幾種HLA基因分型方法作一概述。

2 方法

2.1 PCR-SSOP(序列特異性寡核苷酸探針)

PCR-SSOP是以核酸雜交為基礎(chǔ)的分型技術(shù)。其原理是：先對HLA的多態(tài)區(qū)域進行擴增，在擴增過程中對PCR產(chǎn)物進行同位素或非同位素標記，然后針對PCR擴增產(chǎn)物根據(jù)堿基配對原則設(shè)計系列寡核苷酸探針固定在膜上，最后將PCR產(chǎn)物與膜上的探針雜交、放射自顯影根據(jù)信號判斷結(jié)果。該方法靈敏度非常高，1個堿基的差異都能被檢測出來[2]。

PCR-SSOP技術(shù)用于HLA分型主要包括正相SSOP方法和反相 SSOP方法兩種。前者是將PCR產(chǎn)物固定在膜上，用標記的探針與之進行雜交，后者是將特異性探針固定在膜上， 用標記的PCR產(chǎn)物與之雜交[3]。目前廣泛采用的是反相 SSOP方法。它特別適合于大批量實驗，如在臍血庫和骨髓庫HLA分型中作為首選的方法。與傳統(tǒng)方法相比較，PCRSSOP法具有靈敏度高、特異性強、需樣品量少等優(yōu)點。它不象電泳技術(shù)那樣，在鑒定不同系列凝膠中DNA片段的精確大小時，存在誤差等問題，因此可用于其它技術(shù)不易分辨的等位基因的檢測及位點的鑒定。到目前為止。各國學(xué)者設(shè)計的探針，可用于檢測幾乎所有目前所知HLA等位基因。

2.2 PCR-RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)

九十年代初隨著PCR方法與之結(jié)合，該方法得到普遍推廣。其原理是：HLA特異等位基因內(nèi)部存在多個核酸內(nèi)切酶位點，由于不同的HLA特異等位基因之間存在著核苷酸的差異，用相同的限制性核酸內(nèi)切酶去消化這些特異性等位基因的差異位點，會得到不同長度、不同數(shù)目的DNA片段。經(jīng)電泳，溴乙錠染色，紫外照射成像后借助HLA分型程序或手工查表即可確定HLA基因型別。鄔于川[4]等應(yīng)用PCR-RFLP方法進行了HLA-DPB1等位基因與四川漢族人哮喘的相關(guān)性研究。

PCR-RFLP法準確性好，但選擇怎樣的核酸內(nèi)切酶來消化和區(qū)分所有等位基因是該技術(shù)的關(guān)鍵問題?，F(xiàn)可通過計算機軟件輔助解決該問題，但是如果等位基因PCR擴增片段中只有1～2個核苷酸差別時，可能找不到能對它們加以區(qū)分的特異的限制性核酸內(nèi)切酶，需做PCR-SSCP補充區(qū)分。而且有時由于實驗條件等原因,擴增產(chǎn)物有不被內(nèi)切酶消化切割的可能。PCR-PFLP由于其技術(shù)復(fù)雜與HLA本身高度多態(tài)性，其限制性片段格局表現(xiàn)異常復(fù)雜,使其在HLA研究領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用受到一定程度的限制。

2.3 PCR-SSP(序列特異性引物)

根據(jù)HLA各型別核苷酸堿基序列差異性，設(shè)計出一系列特異性引物。因Taq DNA聚合酶沒有3′→5′核酸內(nèi)切酶活性，引物3′端最后一個堿基是否與模板配對決定著能否擴增出產(chǎn)物。若將引物的3′端最后一個堿基設(shè)計在各特異性之間正好有差異的那個堿基序列上，則擴增產(chǎn)物僅需常規(guī)瓊脂糖電泳，根據(jù)特異產(chǎn)物存在與否即可直接對HLA基因進行型。該方法關(guān)鍵是特異引物的設(shè)計與PCR體系的準確無誤。可通過提高退火溫度，加入內(nèi)源性陽性對照等措施確保產(chǎn)物的特異性和反應(yīng)體系的特異性。黃飛[5]等進行PCR-SSP/PCR-SBT-HLA高分辨等位基因分型比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法具有實驗互補意義。若同時應(yīng)用兩種方法能夠有效改善HLA等位基因高分辨分型的準確性和重復(fù)一致率。

PCR-SSP與 PCR-SSOP，PCR-RFLP 相比較，具有以下特點：(1)高度特異性：針對各等位基因順序設(shè)計的引物，從PCR第一個循環(huán)開始就是特異性擴增，提高退火溫度又加強了這種特異性。(2)簡便而迅速地結(jié)果判斷。(3)高度分辨率：每對引物對特定順序片段進行百萬倍以上的擴增,產(chǎn)物分辨率高。但是用PCR-SSP法由于涉及多對引物進行檢測，實驗成本高，而且由于特異引物的有限性，有些罕見的HLA-DR特異性難以用此方法檢出。

2.4 PCR-SNP(單核苷酸多態(tài)性)

單核苷酸多態(tài)性是人類基因組中存在的以每1000個堿基出現(xiàn)1～10個穩(wěn)定遺傳雙等位基因的單堿基對差異，它可能是人類基因表達和蛋白活動中的一個功能性成分。目前已在HLA-I類基因內(nèi)以400bp一個SNP的密度發(fā)現(xiàn) 了大量的SNP，這為高通量主要組織相容性復(fù)合物 (MHC)-SNP檢測奠定了基礎(chǔ)，該技術(shù)較其它技術(shù)節(jié)省時間和費用。隨著第3代遺傳標記SNP的發(fā)展，有望在HLA復(fù)合體中尋找到一系列SNP位點，并繪制其高密度SNP圖譜，進一步研制MHC-SNP試劑盒以對HLA進行分型。

因此，第13屆IHWC提出了制作HLA區(qū)域內(nèi)高密度SNP圖，研發(fā)HLA-SNP分型試劑盒，使SNP技術(shù)成為一種簡易有效的HLA分型方法的目標。2.5 SBT(直接測序分型)

SBT原理是：首先用 PCR擴增獲得DNA片段，然后采用測序反應(yīng)獲得擴增片段的堿基序列。由于獲得了擴增片斷的全部堿基序列，故該方法是最可靠也最徹底的基因分型方法，它不僅能進行序列識別和分型，更有助于發(fā)現(xiàn)新的基因型，目前只有通過測序才可準確證實新發(fā)現(xiàn)的HLA等位基因。已有報道，血清學(xué)結(jié)果為空白或PCR-SSP和PCR-SSOP未能檢出或幾種分型結(jié)果不一致時，均可通過SBT技術(shù)獲得準確、可靠的高分辨結(jié)果[6]。Hurley[7]等采用PCR-SBT法對美國NMDP 1775名骨髓移植患者和無關(guān)供者作HLA等位基因分型，分析HLA-A，HLA-B，HLA-DR抗原匹配情況發(fā)現(xiàn)，骨髓移植病人和供者間HLA等位基因的不匹配情況遠遠超出預(yù)想。

SBT之所以優(yōu)于PCR-SSP和PCR-SSOP，主要在于它能分析包括非多態(tài)性位點在內(nèi)的整個基因組序列。且SBT不但可以對DNA測序，也可對cDNA測序來分析基因的表達。隨著DNA測序技術(shù)的普及，該方法越來越受到重視。PCR-SBT法無論在分型精確度、工作效率還是自動化程度都明顯優(yōu)于其他幾種分型方法，目前已有專門的HLA分型軟件與自動上樣的固相測序試劑盒，而且測序費用大大降低。因此，PCR-SBT法是科研工作中最理想的HLA分型方法，隨著自動核酸測序成本的降低，這一分型技術(shù)將被廣泛應(yīng)用[8]。

2.6 基因芯片或DNA微陣列技術(shù)

基因芯片技術(shù)由美國Affymetrix公司首先開發(fā)。短短數(shù)年中，芯片技術(shù)進展迅速。其原理為反向斑點雜交，即通過點樣儀將成千上萬個代表不同基因的寡核苷酸探針點樣于固相支持物表面，這些探針可與放射性標記物或熒光素標記的樣品DNA或cDNA互補核酸序列相結(jié)合，通過放射自顯影或熒光檢測，雜交結(jié)果通過計算機軟件處理分析后獲得雜交信號的強度及分布模式圖，從而反映樣品中基因表達的情況。

與現(xiàn)有的分型技術(shù)比較，基因芯片分型有如下優(yōu)勢：①具有集成化的優(yōu)點；②操作非常簡便：結(jié)果判讀通過熒光掃描，而不是凝膠電泳，大大簡化了操作，縮短了時間；③靈敏度高：芯片通過2級放大，第1級是在PCR擴增模板D NA時，第2級是在讀取雜交結(jié)果時熒光素的2級放大，大大提高了靈敏度；④效率高：只需要1張芯片，1次PCR，1次雜交就可以對多個樣本進行 HLA-A、B、D R、DQ等位點DNA分型；⑤標準化程度高：采用多種、多點、同步雜交法檢測靶基因和自動化分析結(jié)果，可確保檢測特異性和客觀性，最大限度減少人為誤差；⑥成本較低：由于芯片制作和檢測的自動化程度較高，并且固定在芯片上探針量和PCR所用的樣本量很小，芯片可以實現(xiàn)單片多人用，由此使檢測的成本降低。這些會促使HLA基因芯片分型技術(shù)在臨床上得到廣泛應(yīng)用[9]。但是，目前基因芯片還存在著儀器設(shè)備昂貴，方法有待標準化以及信號檢測低等不足，相信這些問題很快就會得到解決，一旦這種高效的分型方法用于臨床 必然會 帶來巨大的經(jīng)濟效益與社會效益。

3 展望

上面談及的幾種基因水平上HLA分型方法，是近年來國內(nèi)外研究得較多的。各種HLA基因分型方法各有優(yōu)勢，不能相互替代。例如PCR-SSP操作簡單、快速，但要進行高分辨基因分型，就需要設(shè)計大量的序列特異性引物，使整個實驗變得十分昂貴，而且操作流程延長。PCR-SSOP進行高分辨基因分型時，也會出現(xiàn)價格昂貴，流程復(fù)雜的問題 ，故大有被基因芯片所取代的趨勢。芯片自動化程度較高，所需探針量和PCR所用樣本量很小，芯片可以實現(xiàn)單片多人使用，由此使檢測的成本降低。但由于儀器昂貴，在一定程度上制約了其推廣和應(yīng)用。PCRSNP技術(shù)簡單、快捷、分辨率高，隨著其技術(shù)的不斷改進,有望成為最為普及的HLA分型方法。SBT是一種分辨率最高、最可靠的分型方法，但由于其價格昂貴,限制其普及使用。為此，不同科研與醫(yī)療機構(gòu)實驗室應(yīng)根據(jù)各自的條件、要求和目的而選用合適的方法。就臨床組織器官移植而言，采用中分辨度DNA分型技術(shù)是最佳選擇，劉川[10]等應(yīng)用PCR-SSP方法進行了造血干細胞移植的HLA分型，獲得了準確的結(jié)果。就科研工作而言，一般采用高分辨率分型方法。隨著各學(xué)科之間的滲透與交叉，加強HLA基因分型方法的標準化，使分型向最快最準確的方向發(fā)展，將有助于推動HLA的相關(guān)研究和各領(lǐng)域研究成果的相互借鑒[11]。

[1]Horton R,Wilming L,Rand V,et al.Genemap of the extender human MHC[J].Nature Rev Genet,2004,5(12):889-899.

[2]Hoppe B,Salama A.Sequencing-based typing of HLA[J].Methods Mol Med,2007,134:71-80.

[3]Dalva K,Beksac M.HLA typing with sequence-specific oligonucleotide primed PCR(PCR-SSO)and use of the Luminex technology[J].Methods Mol Med,2007,134:61-69.

[4]鄔于川,劉春華,范冬梅.HLA-DPB1等位基因與四川漢族人哮喘的相關(guān)性研究[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2007,14(2):162-164.

[5]黃 飛,肖露露,閻文瑛.PCR-SSP/PCR-SBT-HLA高分辨等位基因分型比較[J].中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2006,27(3S):21-24.

[6]Perz JB,Szydlo R,Sergeant R,et al.Impact of HLA classⅠand classⅡDNA high-resolution HLA typing on clinical outcome in adult unrelated stem cell transplantation after in vivo T-cell depletion with alemtuzumab[J].Transplant Immunology,2007,5:1-7.

[7]Hurley CK,Fernandez-Vina M,Hildebrand WH,et al.A high degree of HLA disparity arises from limited allelic diversity:analysis of 1775 unrelated bonemarrow transplant donor-recipient pairs[J].Hum mmunol,2007,68(1):30-40.

[8]Van Dijk A,Melchers R,Hilkes Y,et al.HLA-DRB sequencingbased typing:an improved protocolwhich shows complete DRB exon 2 sequences and includes exon 3 of HLA-DRB4/5[J].Tissue Antigens,2007,69(1):61-63.

[9]Ringquist S,Styche A,Rudert WA,et al.Pyrosequencing-based strategies for improved allele typing of human leukocyte antigen loci[J].Methods Mol Biol,2007,373:115-134.

[10]劉 川,鄒葉青,李 劍.人類白細胞抗原(HLA)基因分型在造血干細胞移植中的應(yīng)用[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2008,26(6);587-588.

[11]AbbottWG,Tuku itonga CF,Ofanoa M,et al.Low-cost,simultaneous,single-sequence genotyping of the HLA-A,HLA-B and HLA-C loci[J].Tissue Antigens,2006,68(1):28-37.