張海江，胡靜雅，袁日琴

(淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇淮安223003)

0 引言

復方丹參片由中藥丹參、三七及冰片所組成，具有活血化瘀、調經(jīng)止痛、安神寧心的功效，臨床主要用于治療冠心病心絞痛及急性心肌梗死。丹參脂溶性成分被認為是復方丹參片的活性成分之一，主要有隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA，并已有文獻對這些成分的HPLC含量測定方法進行了研究。中國藥典以丹參酮IIA作為丹參脂溶性成分的標示化合物進行復方丹參片的質控，難以準確反映復方丹參片的質量。現(xiàn)有的復方丹參片中丹參脂溶性成分含量測定方法的研究僅針對其中的二至三種，同時測定以上所有四種成分的分析方法尚未見文獻報道。本文首先采用液質聯(lián)用技術分析復方丹參片中的丹參脂溶性成分組成。在此基礎上，建立了HPLC含量測定方法，同時測定隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型 HPLC儀(G1311A四元泵，G1322A脫氣機，G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315BDAD檢測器，Chemstation色譜工作站)，Bruker Esquire Ultra 6000電噴霧－離子阱質譜儀。

1.2 試藥

丹參酮I、丹參酮IIA對照品購自中國生物藥品檢驗所，二氫丹參酮、隱丹參酮對照品購自成都康邦生物科技有限公司(HPLC方法分析，以面積歸一化法計算純度均大于98.5%)。甲醇、乙腈為色譜純(美國Merck公司)，乙酸為分析純(江蘇漢邦科技有限公司)。復方丹參片(市售:北京某廠家，批號:9122172;廣州某廠家，批號:B9A023;河南某廠家，批號:20090801;遼寧某廠家，批號:090504;上海某廠家，批號:100101。)

1.3 試液制備

對照品貯備液:取對照品二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA適量，精密稱定，加入甲醇制成對照品混合液，即得。

供試品溶液的制備:取復方丹參片，除去糖衣，研細，取約1 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，放入50 mL容量瓶中，超聲處理15 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用尼龍膜濾過即得。

1.4 色譜/質譜分析條件

色譜柱:Venusil－XBP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm，Agela公司)帶 C18 預柱(5 μm);流動相A為冰乙酸:水=0.01:100(體積比)，流動相B為冰乙酸:乙腈=0.01:100，提取方法優(yōu)化的線性洗脫梯度為:0～2min時0%B(體積分數(shù))，20 min時 15%B，35 min時 45%B，35～45 min時45%B，60 min時75%B，60 ～80 min時 75%B，90 min時90%B;含量測定的線性洗脫梯度為:0～5min時 60%B，10～25 min時 70%B，30 min時90%B，流量為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為190～400 nm，監(jiān)測波長為280 nm，進樣量為10 μL。

質譜分析條件:正離子檢測方式。分流后進入質譜儀，流量為0.25 mL/min，干燥氣體N2流量為10 L/min，干燥氣溫度為300℃，噴霧氣體N2壓力為25 psi，毛細管電壓為3500 v，掃描的質荷比范圍為100～1500 m/z。HPLC/MSn的掃描寬度為0.9，CID 的 Fragment ampl.為 1.5。

2 實驗結果與討論

2.1 提取方法優(yōu)化

取廣州廠家的復方丹參片，除去糖衣，研細，稱取約1 g，放入50 ml的容量瓶中，分別以純水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和純甲醇為提取溶劑，參照藥典方法，各加入25 ml，超聲處理15 min，放冷，以提取溶劑稀釋至刻度，過濾后按“1.3”項下提取方法優(yōu)化色譜條件進行HPLC分析，進樣量20 μL。結果見圖 1。

圖中保留時間在60 min之前的為丹參水溶性成分，60min之后的為丹參脂溶性成分。結果表明，隨著提取溶劑中甲醇含量的增加，提取物中水溶性成分含量降低，脂溶性成分含量增大。因此，采用純水作為丹參水溶性成分的提取溶劑，采用甲醇作為丹參脂溶性成分的提取溶劑。

通過對溶劑倍數(shù)與超聲提取時間的優(yōu)化，得“1.3”項下的提取條件。

圖1 復方丹參片不同濃度甲醇提取液的HPLC圖

2.2 丹參脂溶性成分的定性分析

取廣州廠家復方丹參片，按“1.3”項方法制備供試品溶液，按“1.4”項含量測定色譜條件和質譜條件進行HPLC/MS分析，進樣量為20 μL，結果見圖2和表1。

通過與對照品的HPLC保留時間、UV圖譜及MS數(shù)據(jù)對比，鑒定主要成分為二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA。

圖2 復方丹參片中丹參脂溶性成分的HPLC圖譜(a)，MS－TIC圖譜(b)與標準品的HPLC圖譜(c)

表1 復方丹參片中丹參脂溶性成分的HPLC/MS數(shù)據(jù)及鑒定結果

2.3 線性關系考察

逐級稀釋對照品儲備液1～100倍得到7個不同濃度的對照品溶液，按“1.4”項下的色譜條件進行分析，進樣量為10 μL。以色譜峰面積為縱坐標，對照品溶液濃度(mg·mL－1)為橫坐標，繪制工作曲線，計算回歸方程，見表2。

表2 各化合物的線性回歸方程

2.4 精密度試驗

按“1.3”項方法制備供試品溶液，按“1.4”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算精密度。二氫丹參酮 RSD 0.88%，隱丹參酮 RSD 0.42%，丹參酮I的RSD 0.26%，丹參酮IIA的RSD 0.28%。

2.5 重復性試驗

按“1.3”項下方法制備同一批供試品溶液3份，進行HPLC分析(n=3)，計算每克復方丹參片中的各成分含量。二氫丹參酮含量 0.55 mg·g－1，RSD 1.86%;隱丹參酮含量 1.14 mg·g－1，RSD1.32%;丹參酮I含量2.70 mg·g－1，RSD 1.03%;丹參酮IIA含量1.86 mg·g－1，RSD 0.89%。

2.6 穩(wěn)定性試驗

按“1.3”項方法制備供試品溶液，按“1.3”項下色譜條件連續(xù)3 d內進樣測定，每天連續(xù)進樣3次，測定峰面積，計算二氫丹參酮RSD 1.42%，隱丹參酮 RSD 0.95%，丹參酮 I的RSD 0.93%，丹參酮IIA的RSD 0.77%，表明樣品溶液至少在48 h內穩(wěn)定。

2.7 加樣回收試驗

配制二氫丹參酮 0.240 mg·mL－1、隱丹參酮0.448 mg·mL－1、丹參酮 I 1.080 mg·mL－1、丹參酮 IIA 0.778 mg·mL－1的對照品溶液 10 mL。分別精確量取0.8，1.0，1.2 mL 的對照品溶液各3 份于錐形瓶中，揮干，每份加入精密量取的廣州廠家復方丹參片粉末約0.4 g，混合均勻，精密加入10 mL甲醇，按“1.3”項下方法制得供試品。按“1.4”項下色譜條件進行HPLC分析，每個樣品進樣3次，計算平均加樣回收率。

2.8 樣品測定結果

各廠家藥片除去糖衣，研細，按“1.3”項下方法分別制備供試品溶液各3批，按“1.4”項色譜條件分析，每個樣品進樣3次，分別計算各廠家1 g復方丹參片中二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量(mg·g－1)，結果見表4。

表4 復方丹參片中的主要丹參脂溶性成分含量(mg·g－1)

3 結論

本研究采用液質聯(lián)用技術對復方丹參片中的丹參脂溶性成分進行了鑒定，在此基礎上建立了4種主要丹參酮成分的HPLC含量測定分析方法?？疾旖Y果表明，本方法準確可靠、操作簡單、快速。對市場上五個廠家的復方丹參片分析結果表明，各廠家的丹參酮成分組成較為相似，主要成分均為二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA，丹參酮ⅡA含量均符合藥典2005年版該品種每片含丹參酮ⅡA不得低于0.2 mg的規(guī)定。但各廠家的丹參成分含量差異較大。其中，丹參酮ⅡA的含量在1.01～1.90 mg·g－1，最大相差近一倍;丹參酮I含量最大相差4倍;二氫丹參酮和隱丹參酮含量最大相差達到10倍之多。因此，有必要提高復方丹參片的質量控制標準，使市場上復方丹參片的質量穩(wěn)定性得到更加有效的保障。

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