張姍姍

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島 266042)

微生物維生素E產(chǎn)業(yè)化開發(fā)進(jìn)展

張姍姍

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島 266042)

維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，僅在光合細(xì)菌和高等植物中合成，具有重要的生理學(xué)功能。纖細(xì)裸藻能有效積聚α－生育酚。本文綜述了通過代謝和基因工程、培養(yǎng)系統(tǒng)和反應(yīng)器等方面的研究來有效生產(chǎn)生育酚的進(jìn)展情況，旨在促使工業(yè)化生產(chǎn)維生素E成為可能。

維生素E;纖細(xì)裸藻;培養(yǎng)系統(tǒng);光生物反應(yīng)器

Abstract:Vitamin E are fat－ soluble antioxidants that is synthesized by photosynthetic and higher plant，have most significant physiological roles.Euglena gracilis is promising for commercial production of α －tocopherols，this prograph have investigated metabolic and genetic engineering、cultivation systems and photobioreactors for efficient production of tocopherol，make it possible for large － scale commercial production.

Key words:vitamin E;euglena gracilis;cultivation systems;photobioreactors

1 簡介

維生素E(VE)是光合作用細(xì)胞合成的脂溶性抗氧化劑。維生素E臨床上可用于治療老年性癡呆癥、高血壓、冠心病、心肌梗塞、動脈硬化、血栓和不孕癥等［1］。作為抗氧化劑和自由基捕獲劑，維生素E還可以保護(hù)類囊體成分免受氧化破壞，在電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)、細(xì)胞膜滲透性和流動性方面有重要作用，因此它可以用作膜穩(wěn)定劑。

VE的生理學(xué)活性高，天然VE作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑和抗氧化劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品、營養(yǎng)品和化妝品中，但價(jià)格昂貴主要供人類使用?；瘜W(xué)合成的價(jià)格低廉，但中間產(chǎn)物對人體健康有潛在威脅，只用于飼料加工。VE是生育酚類化合物的總稱。根據(jù)類異戊二烯基側(cè)鏈飽和度的不同分為生育酚和生育三烯酚，根據(jù)芳環(huán)上甲基位置和數(shù)目的不同又各有α、β、δ及γ 4種類型。其中α－生育酚生物學(xué)活性最高［2］。所有的同系物存在于植物和光合作用的微生物中，它們的濃度和比例取決于植物種類、組織、微生物和培養(yǎng)條件。由于α－生育酚是最有效的亞型，因此選擇有利于它合成的菌株和培養(yǎng)條件來發(fā)酵生產(chǎn)。

2 天然生育酚的來源

2.1 高等植物作為生育酚的來源

生育酚普遍存在于植物組織，尤其是雙子葉植物的葉和種子、豆油、麥麩和小麥胚芽中。傳統(tǒng)上，用有機(jī)溶劑如己烷來提取植物組織中的生育酚;現(xiàn)在考慮使用超臨界流體如超臨界CO2來提?。?］。植物油富含生育酚，但是高等植物作為其來源存在一個問題，就是生育酚含量很低。

2.2 微生物作為生育酚的來源

微生物希望有高生育酚濃度、高比例α－生育酚、高細(xì)胞生長率、高細(xì)胞濃度、簡單的培養(yǎng)條件、便宜的培養(yǎng)媒介、低污染敏感性等特點(diǎn)。能積累生育酚的微藻有螺旋藻、杜氏藻、集胞藻、綠藻等［4］。菌種中研究最廣泛的是裸藻，其生育酚濃度為每克細(xì)胞中1.12～7.35mg。研究發(fā)現(xiàn)纖細(xì)裸藻有最高的生育酚生產(chǎn)力［5］;并且能獲得高密度細(xì)胞，是少數(shù)幾個能同時(shí)生產(chǎn)β胡蘿卜素、維生素C和維生素E的微生物之一［6］，其合成的生育酚超過97%是α型，沒有細(xì)胞壁，可以很容易地提取生育酚。與其他微生物相比，裸藻有很好的開發(fā)潛力和發(fā)展前景，所以主要討論這種光合細(xì)菌。

為了大量合成而對植物和微生物進(jìn)行了基因工程和代謝工程。分析生育酚合成的原理和反應(yīng)，已經(jīng)克隆了5個酶的基因并做了功能鑒定，這些基因?qū)⒗谖覀冊诜肿雍蜕缴涎芯亢筒僮鱒E合成。依據(jù)表達(dá)的酶在合成中的作用將這些基因分成兩類:一類主要提高VE總量，另一類主要影響VE成分。正常培養(yǎng)條件下，微生物積累的超過90%是α－生育酚，因此，微生物的基因工程應(yīng)旨在增加VE總量。

VE的芳香性前體是尿黑酸和對羥基苯丙酮酸，合成對羥基苯丙酮酸是植物積聚VE的限制性步驟。通過表達(dá)煙草植物里的預(yù)苯酸脫氫酶基因和過表達(dá)擬南芥的對羥基苯丙酮酸二加氧酶HPPD序列，在預(yù)苯酸水平上合成VE，這能高度積累生育酚［7］。玉米種子中HGGT的過表達(dá)使生育酚和生育三烯酚增加了6倍［8］，并采用分子標(biāo)記輔助作用。多種途徑旨在增加植物中VE總量。

高等植物基因或代謝工程的研究很多，而微生物的研究很少。集胞藻屬中的藍(lán)藻菌株P(guān)CC 6803具有進(jìn)行基因工程良好的特點(diǎn)。誘導(dǎo)表達(dá)HPPD基因時(shí)，總VE增加了5倍。但是沒有高生育酚生產(chǎn)者的基因修改報(bào)告。

葉綠體缺陷纖細(xì)裸藻W14ZUL菌株中增加有機(jī)碳源能增加線粒體的活性、活性氧濃度和α－生育酚的生產(chǎn)力。野生型裸藻Z的異養(yǎng)培養(yǎng)中，活性氧的產(chǎn)生與α－生育酚的生產(chǎn)力之間正相關(guān)。因此，其最優(yōu)化培養(yǎng)條件必須控制這些因素;而且，適合細(xì)胞生長的條件不一定適合積聚生育酚。

光似乎是影響生育酚生產(chǎn)的最重要因素，光強(qiáng)度和生育酚積聚存在正相關(guān)性。連續(xù)光照比光暗循環(huán)積聚的生育酚多，葉綠體和線粒體都參與了生育酚的合成，Kusmic等人說缺少葉綠體的裸藻中光都能促進(jìn)生育酚合成。細(xì)胞器的相對貢獻(xiàn)依賴于培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基的組成也會影響生育酚合成。

3 培養(yǎng)系統(tǒng)

3.1 光合自養(yǎng)培養(yǎng)

光合自養(yǎng)是培養(yǎng)光合作用微生物最普遍的方法。光合自養(yǎng)污染危險(xiǎn)小時(shí)，α－生育酚的積聚量很高;但在生長晚期細(xì)胞開始死亡和溶解，異養(yǎng)生物引起污染。光合自養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，限制細(xì)胞生長和α－生育酚積聚的主要問題是光照的供給(數(shù)量、質(zhì)量和分布)。太陽光作為唯一光源時(shí)，細(xì)胞量和生育酚積聚主要取決于天氣條件。光照時(shí)間依賴于位置和時(shí)期，它可能很短，故大部分時(shí)期培養(yǎng)受光照限制，生育酚積聚很低?，F(xiàn)已發(fā)明整合太陽光和人造光來持續(xù)照明。當(dāng)太陽光強(qiáng)度降到設(shè)定值時(shí)，系統(tǒng)自動從太陽光轉(zhuǎn)為人造光。純光合自養(yǎng)適用于小規(guī)模α－生育酚生產(chǎn)，它操作簡單，投資和運(yùn)營成本低，但其生產(chǎn)力和生物量很低，不適合商業(yè)在生產(chǎn)。

3.2 異養(yǎng)培養(yǎng)

裸藻和其他微生物(如綠藻、衣藻等)在缺少光照條件下能利用有機(jī)碳進(jìn)行異養(yǎng)生長，雖然異養(yǎng)生長的裸藻生育酚含量比光合自養(yǎng)低，但異養(yǎng)生物反應(yīng)器也可以生產(chǎn)生育酚。通過優(yōu)化有機(jī)碳源和通氣量條件，可以得到高濃度細(xì)胞和生育酚含量。由于光能成本高和反應(yīng)器內(nèi)部光分散的技術(shù)問題，異養(yǎng)培養(yǎng)商業(yè)化生產(chǎn)生育酚可能性很高［9］。

3.3 光能異養(yǎng)培養(yǎng)

光合自養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞濃度低、生育酚濃度高，異養(yǎng)培養(yǎng)則相反，光異養(yǎng)培養(yǎng)能同時(shí)獲得高濃度的細(xì)胞和生育酚。光異養(yǎng)培養(yǎng)中，光合自養(yǎng)和異養(yǎng)的代謝活動之間存在相互作用。葡萄糖作為裸藻的有機(jī)碳時(shí)，低光強(qiáng)度下光合自養(yǎng)和異養(yǎng)代謝活動同時(shí)獨(dú)立進(jìn)行，因此光異養(yǎng)培養(yǎng)的生長速率和最終細(xì)胞濃度值是兩者的加和。然而，高光照強(qiáng)度抑制了光合作用和葡萄糖的吸收，導(dǎo)致細(xì)胞濃度降低，但生育酚濃度卻很高。說明異養(yǎng)代謝對光抑制作用的敏感性高于光合自養(yǎng)。裸藻進(jìn)行光異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，適合細(xì)胞生長的條件與利于α－生育酚積聚的條件不同。細(xì)胞的生長受有機(jī)碳吸收的控制，而α－生育酚積聚則受光合自養(yǎng)代謝的控制。為得到高濃度的細(xì)胞和α－生育酚，應(yīng)調(diào)節(jié)兩種代謝活動的比例。光合自養(yǎng)對細(xì)胞生長的貢獻(xiàn)會隨著光強(qiáng)度、通氣中CO2濃度的增加和有機(jī)碳源供料速度的降低而增加。限制有機(jī)碳使代謝平衡轉(zhuǎn)移到光合自養(yǎng)上。若有機(jī)碳過量，就算在高光強(qiáng)度下α－生育酚量也很低。微生物培養(yǎng)可以利用許多有機(jī)碳，如乙醇、乳酸和半乳糖等可以有效地積聚α－生育酚，葡萄糖和果糖則有利于細(xì)胞的生長，且混合基質(zhì)比單個有效［10］。

裸藻光異養(yǎng)培養(yǎng)積聚α－生育酚的潛能很高?？梢垣@得相當(dāng)高的生產(chǎn)力，且光合作用產(chǎn)生的氧被有機(jī)碳吸收，同時(shí)碳同化釋放的二氧化碳被光合作用利用。

3.4 相繼的異養(yǎng)—光合自養(yǎng)培養(yǎng)

在光能異養(yǎng)培養(yǎng)中，適合有機(jī)碳吸收的條件與生育酚積聚的條件不同。為了得到最高容量的生育酚生產(chǎn)率，優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)必須在兩者之間做出妥協(xié)。從光合自養(yǎng)活動中分離有機(jī)碳，吸收作用可以避免這一問題，分別優(yōu)化它們。在異樣培養(yǎng)條件下，纖細(xì)裸藻Z生產(chǎn)的細(xì)胞量比光能自養(yǎng)條件多，但維生素卻相對較少。為增加VE量，應(yīng)用兩步培養(yǎng)，即先將細(xì)胞在異養(yǎng)條件下培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到自養(yǎng)下繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在高細(xì)胞密度下利用兩步培養(yǎng)，纖細(xì)裸藻的VE生產(chǎn)能力有了明顯提高。異養(yǎng)末期獲得的細(xì)胞濃度取決于光合自養(yǎng)階段光的提供。在有機(jī)碳類型、濃度、通氣量、培養(yǎng)基成分和流體力學(xué)壓力方面來優(yōu)化異養(yǎng)階段;另一方面，在初始細(xì)胞濃度、光強(qiáng)度和分布、CO2供給、培養(yǎng)基組成等方面優(yōu)化光合自養(yǎng)。傳統(tǒng)的異養(yǎng)生物反應(yīng)器，在異養(yǎng)階段能夠保持單一培養(yǎng)，開放池塘中進(jìn)行的光合自養(yǎng)，污染也不是個嚴(yán)重問題;因?yàn)樗?xì)胞濃度高、培養(yǎng)期限短且缺少有機(jī)碳。

3.5 循環(huán)的光合自養(yǎng)—異養(yǎng)培養(yǎng)

光生物反應(yīng)器照明的能耗很高，且太陽光不穩(wěn)定，每天只有不到6h的有效光適合光合作用細(xì)胞生長。黑暗條件下，細(xì)胞不能生長，還消耗有機(jī)碳，使細(xì)胞濃度降低。循環(huán)性光合自養(yǎng)—異養(yǎng)培養(yǎng)能解決這個問題，它使有機(jī)碳量在晚上增加，可以獲得光、暗循環(huán)下連續(xù)生長的細(xì)胞［11］。為了獲得最大生產(chǎn)率，須選擇合適的有機(jī)碳源，且添加恰好的量使沒有剩余的有機(jī)碳轉(zhuǎn)入到光周期里。當(dāng)葡萄糖作為有機(jī)碳時(shí)，在異養(yǎng)階段的夜里，α－生育酚的濃度會降低，但會在光合自養(yǎng)階段恢復(fù)。但用乙醇時(shí)，α－生育酚的濃度在這兩個階段會保持穩(wěn)定。光合自養(yǎng)階段若只利用太陽光，光強(qiáng)度波動會影響α－生育酚的量。使用太陽光、人造光和有機(jī)碳供給的整合系統(tǒng)［12］，光源在光亮?xí)r為太陽光，陰天時(shí)自動會轉(zhuǎn)為人造光。確保了光合自養(yǎng)階段穩(wěn)定的光供給，相同培養(yǎng)條件下α－生育酚的量是純光合自養(yǎng)的5倍。

4 光生物反應(yīng)器

光生物反應(yīng)器包括開放培養(yǎng)系統(tǒng)(如自然水域、人工池塘等)和封閉光生物反應(yīng)器(如管狀光生物反應(yīng)器、平板光生物反應(yīng)器等)。傳統(tǒng)海洋微藻多采用開放式培養(yǎng)系統(tǒng)，存在培養(yǎng)條件難以控制、生產(chǎn)周期受季節(jié)限制、易受污染等不可克服的缺點(diǎn)［13］。管狀光生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)移量低，異養(yǎng)代謝很難維持無菌條件，故也不適合。

光生物反應(yīng)器應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)成平板或垂直塔形狀的。相對長的光途徑(＞50cm)或者局部陰影能使細(xì)胞生長和α－生育酚積聚之間保持良好平衡。平板式光生物反應(yīng)器具有高液體循環(huán)速度和較小的光衰減度，更利于藻體細(xì)胞對光的吸收，操作簡單、容易放大，適合于微藻的規(guī)模化高密度培養(yǎng)。

5 未來展望

VE具有顯著的生理活性，是人類生命活動中不可缺少的物質(zhì)。近年來，微藻合成VE已成為研究的熱點(diǎn)。微藻工業(yè)化生產(chǎn)VE要考慮很多因素，有經(jīng)濟(jì)成本、污染問題、培養(yǎng)系統(tǒng)、培養(yǎng)裝置、光源和有機(jī)碳源等。目前還不能用裸藻大規(guī)模生產(chǎn)生育酚，今后研究分析生物學(xué)、基因工程、光生物反應(yīng)器和微生物培養(yǎng)中的成熟技術(shù)和設(shè)備，利于調(diào)控和優(yōu)化培養(yǎng)，易于規(guī)模放大，勢必會加快微藻及其產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

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Progress of Industrialization Development of Microorganism Vitamin E

ZHANG Shan－Shan
(College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao 266042，China)

TQ466.5

A

1003－3467(2011)03－0032－03

2010－10－26

張姍姍(1987－)，女，碩士研究生，從事藥物與生物工程研究，電話:13791913034。