程井軍(湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸基礎(chǔ)教研室，湖北 武漢430061）

李德順(湖北中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教研室，湖北 武漢430061）

馬 駿，沈 峰(湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)教研室，湖北 武漢430061）

齊鳳軍(湖北中醫(yī)藥大學(xué)推拿學(xué)教研室，湖北 武漢430061）

孫國杰(湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)教研室，湖北 武漢430061）

非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）與肥胖、高脂血癥和糖尿病高度相關(guān)[1]，但其發(fā)病機(jī)制不明。我們應(yīng)用電針刺激SD大鼠肝俞、足三里、豐隆、太沖，觀察電針對(duì)高脂飲食所致的非酒精性脂肪性肝炎(NASH）大鼠血清及肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD）和丙二醛(malondialdehyde，MDA）的影響，為臨床治療非酒精性脂肪性肝炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

SPF級(jí)雄性SD大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，批號(hào)2004A068）40只，體質(zhì)量(190±20）g；上海產(chǎn)G-6805針灸治療儀；熊去氧膽酸片(UDCA，成都市湔江制藥廠）；血清超氧化物歧化酶和丙二醛試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物分組與模型建立 選用SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，采用清潔級(jí)架式分籠飼養(yǎng)。所有大鼠均正常喂養(yǎng)1周，再隨機(jī)分為4組。正常對(duì)照組10只，普通飼料喂養(yǎng)；模型組10只，電針組10只，藥物組10只，均采用高脂飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)依據(jù)范建高經(jīng)典造模方法[2]，自由攝食和飲水，飼料和水每日更換1次。針刺組取穴參照全國協(xié)編 《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定肝俞、足三里、豐隆、太沖，電針治療，選用0．5寸長毫針(1cm）電針穴位，上海產(chǎn)G-6805針灸治療儀(疏密波8～80Hz，疏密波轉(zhuǎn)換14次／min，電壓1．5V，強(qiáng)度1mA）通電治療20min，自第12周開始每天治療1次，連續(xù)6d后休息1d，共治療4周。藥物組自第12周開始每天以西藥UDCA 250mg／（kg·d）的水溶液為唯一飲料，繼前高脂食物喂養(yǎng)共4周。正常組和模型對(duì)照組不進(jìn)行電針和藥物治療，喂養(yǎng)共16周。各組在16周后隔夜空腹以2%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)下腔靜脈采血，并頸椎脫臼處死動(dòng)物，摘取肝臟。

1．2．2 觀察項(xiàng)目與測(cè)定方法

1）一般情況。觀察動(dòng)物體質(zhì)量(分別于實(shí)驗(yàn)前至第16周末用電子秤稱量各組大鼠的體質(zhì)量）、食欲、行為、狀態(tài)、毛發(fā)及死亡情況，計(jì)算肝指數(shù)(肝臟濕質(zhì)量／體質(zhì)量×100%）。

2）血清ALT、AST測(cè)定。檢測(cè)血清ALT、AST采用Olympus Au560全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

3）血清SOD、MDA含量測(cè)定。分別采用鄰苯三酚自氧化抑制法、硫代巴比妥熒光法測(cè)定血清SOD、MDA含量。

4）肝組織SOD、MDA含量測(cè)定。按試劑盒操作說明用生物化學(xué)法分別測(cè)定SOD、MDA含量。

5）肝組織病理變化觀察。將肝組織用4℃生理鹽水沖洗，在肝臟最大葉距邊緣5mm處取小塊肝組織，中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織普通病理變化。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS11．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠一般情況變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)模型組和西藥組分別有2只和1只動(dòng)物因相互撕咬而死亡，模型組大鼠體質(zhì)量增長最迅速，食欲好，且動(dòng)物性情較溫順，活動(dòng)減少；第13～16周，電針組體質(zhì)量增加明顯減慢。體質(zhì)量及肝指數(shù)模型組比正常組顯著增高(P＜0．01）；模型組比電針組顯著增高(P＜0．01）；西藥組較之電針組增高(P＜0．05）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)的變化

2．2 各組大鼠肝功能比較

模型組比正常組顯著增高(P＜0．01）；模型組比電針組顯著增高(P＜0．01）；電針組較之西藥組有下降趨勢(shì)，但兩者比較無明顯差異(P＞0．05）。見表2。

表2 各組大鼠肝功能比較

2．3 各組大鼠血清SOD活性、MDA含量的變化

模型組血清MDA顯著高于正常組(P＜0．05），SOD活性顯著低于正常組(P＜0．05）；電針組與模型組比較，MDA含量顯著降低(P＜0．05），而SOD活性明顯升高(P＜0．05）；電針組與藥物組比較，MDA含量有下降趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05）；而SOD活性有下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。見表3。

2．4 各組大鼠肝勻漿SOD活性、MDA含量的變化

模型組肝組織MDA顯著高于正常組(P＜0．05），SOD活性顯著低于正常組(P＜0．05）；電針組與模型組比較，MDA含量顯著降低(P＜0．05），而SOD活性明顯升高(P＜0．05）；電針組與藥物組比較，MDA含量有下降趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05）；而SOD活性亦有下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05）。見表4。

表3 各組大鼠16周時(shí)血清MDA含量、SOD活性比較

表4 各組大鼠16周時(shí)肝組織MDA含量、SOD活性比較

2．5 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)檢查

2．5．1 肝臟外觀形態(tài)觀察 正常組肝臟外觀呈鮮紅色，質(zhì)地軟而富有彈性；模型組肝臟體積呈均勻性增大，邊緣銳利，表面光滑，質(zhì)軟。表面及切面呈黃紅色，有油膩感。電針組及西藥組肉眼觀察差別不明顯，色澤較暗，質(zhì)地、彈性均介于模型組和正常組之間。

2．5．2 光鏡下肝臟病理學(xué)改變 正常組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)排列正常，肝小葉清晰規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)均勻，偶見小泡性脂肪滴空泡；模型組所有大鼠均出現(xiàn)程度不等的彌漫性肝細(xì)胞濁腫、脂肪變性，脂變肝細(xì)胞體積增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量不等、大小不一的脂肪空泡，胞核被推向周邊；肝組織均存在小葉內(nèi)炎癥，大部分組織可見匯管區(qū)炎癥，且出現(xiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)、片狀壞死(見圖1）。電針組肝組織脂肪變程度明顯減輕，肝細(xì)胞形態(tài)趨于正常(見圖2）。西藥組病理學(xué)改變介于模型組和電針組之間。

圖1 模型組大鼠肝細(xì)胞光鏡下形態(tài)(HE，×400）

圖2 電針組大鼠肝細(xì)胞光鏡下形態(tài)(HE，×100）

3 討 論

由單純的脂肪肝發(fā)展至NASH，氧化應(yīng)激或肝中氧化抗氧化平衡失調(diào)，可能是其重要機(jī)制。線粒體是氧化應(yīng)激和活性氧簇(ROS）產(chǎn)生的最大來源[3-4]。肝內(nèi)過多的FFA，特別是多不飽和脂肪酸，可損害細(xì)胞生物膜及線粒體呼吸鏈，使線粒體的改變和呼吸鏈功能不全，從而使脂肪酸β氧化及肝氧化增加，不平衡的氧化磷酸化導(dǎo)致自由基形成[5]；氧化應(yīng)激還與FFA誘導(dǎo)CYPⅡE1和CYP4A表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)。臨床和實(shí)驗(yàn)表明，CYPⅡE1在脂肪性肝病中表達(dá)增強(qiáng)[6]。CYPⅡE1具有很強(qiáng)的氧化活性，是ROS的重要來源。高表達(dá)的CYPⅡE1在氧化基質(zhì)的同時(shí)，釋放大量的ROS和自由基。過多的ROS和自由基耗竭谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等抗氧化因子，使促氧化物與抗氧化物之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，即出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)。

氧化應(yīng)激通過多種途徑促成肝損害：進(jìn)一步影響呼吸鏈[7-8]，直接或間接氧化損害線粒體基因組，導(dǎo)致更多的ROS產(chǎn)生，如此惡性循環(huán)；降低肝谷胱甘肽水平，增加解偶聯(lián)蛋白-2（UCP-2）的表達(dá)，導(dǎo)致ATP耗竭，降低肝細(xì)胞的應(yīng)激能力[9]；使脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量具有反應(yīng)活性和細(xì)胞毒性的中間產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞死亡、壞死，并通過細(xì)胞損傷產(chǎn)生炎癥反應(yīng)或吸引炎癥細(xì)胞浸潤肝實(shí)質(zhì)[10]。此外，脂質(zhì)過氧化還釋放MDA和4-羥基己酸，能刺激Ito細(xì)胞核合成膠原，導(dǎo)致纖維化。4-羥基己酸能趨化中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤，MDA能使包括細(xì)胞骨架蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，形成Mallory小體[11]；提高幾種CKs（TNF-alpha，TGF-beta）的表達(dá)，在細(xì)胞死亡、炎癥反應(yīng)和纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-13]。

針灸對(duì)脂質(zhì)過氧化有重要影響。倫新等[13]取足三里、關(guān)元穴，對(duì)老年人實(shí)行隔姜灸，結(jié)果體內(nèi)血SOD活性明顯升高?？琢⒓t等[14]取單側(cè)肺俞、脾俞、腎俞穴，對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行針灸，結(jié)果能明顯提高大鼠血清SOD的活性。趙立榮等[15]取內(nèi)關(guān)、太沖，可提高小鼠腦組織CAT活性。另外，孫忠人等[16]研究發(fā)現(xiàn)，針刺足三里穴能顯著降低老齡小鼠血清和肝組織中MDA水平。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)：模型組肝組織MDA顯著高于正常組(P＜0．05），SOD活性顯著低于正常組(P＜0．05）；電針組與模型組比較，MDA含量顯著降低(P＜0．05），而SOD活性明顯升高(P＜0．05）；電針組與藥物組比較，MDA含量有下降趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05）；而SOD活性有下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05）。結(jié)果提示，電針能夠提高肝組織抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過氧化，可能是其防治NASH的主要機(jī)制之一。

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