竇巍巍，胡立志，朱秀清*，陳 昊，于殿宇

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150050）

甾醇是一種從植物油工業(yè)副產(chǎn)物中得到的天然活性物質(zhì)，能有效降低有害低密度膽固醇（LDL）的水平，而不影響有益高密度膽固醇（HDL）的水平[1－3]，人體內(nèi)有益高密度膽固醇（HDL）能將組織及動脈壁上多余的膽固醇運輸?shù)礁闻K進行代謝，在機體中起著“清道夫”的作用[4]。甾醇具有降低血膽固醇、抗癌、防治心血管疾病等生理功能[5－6]。在脂肪酶的催化下，通過酯交換反應(yīng)可大大增加甾醇的脂溶性，能比較方便地添加到油脂或含油脂食品中，近年來在西方國家被廣泛應(yīng)用[7]。

植物油中甾醇含量的測定方法很多，早期的分析方法有毛地黃皂苷法、Lieberman－Burchard比色法，毛地黃皂苷法所測得含量稍有偏高，且操作安全性要求較高[8]。目前，主要分析方法有氣相色譜法和高效液相色譜法。這些方法分析精度高，可檢測總甾醇含量及甾醇的組成，但儀器操作和維護要求高、標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴[9]。為尋求一種簡單、快捷、準(zhǔn)確且低成本的測定方法，對適用于食品中膽固醇檢測的國標(biāo)鐵礬顯色法進行了試驗研究，依據(jù)為：從結(jié)構(gòu)上看，甾醇和膽固醇的結(jié)構(gòu)非常相似，所不同的只是C17支鏈上的結(jié)構(gòu)，實際上兩者發(fā)生顏色反應(yīng)的顯色基團是相同的[10]。本試驗確定顯色反應(yīng)的最佳測定條件，最終對酯交換植物油中甾醇的含量進行測定。本研究目的是提出一種測定酯交換植物油中甾醇含量的方法，旨在為測定酯交換植物油中甾醇的含量提供快速而簡單的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

油脂樣品：高油酸葵花籽油一級油（購自大連圣基生物制品有限公司），大豆油一級油（購自九三集團哈爾濱惠康食品有限公司），酯交換植物油。

甾醇（純度≥95%）（購自西安藍天生物工程有限責(zé)任公司），毛地黃皂甙（購自Sigma公司），其他藥品均為分析純。

1.1.2 國標(biāo)鐵礬顯色法試劑配制

鐵礬儲備液：將 4.463 g NH4Fe（SO4）2·12H2O溶解于100 mL 85%磷酸中，貯于干燥器內(nèi)，此液在室溫中穩(wěn)定。

鐵礬顯色液：吸取鐵礬儲備液10 mL，用濃硫酸定容至100 mL。貯于干燥器內(nèi)，以防吸水。

1.1.3 儀器

TU－1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；DK－2000－ⅢL數(shù)顯恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；電子天平，北京賽利多斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 方法

甾醇總含量的測定：采用國標(biāo)鐵礬顯色法[11]、Lieberman－Burchard 比色法[12]和毛地黃皂苷法[13]測定酯交換植物油中甾醇的含量。

1.2.1 國標(biāo)法鐵礬顯色法甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

根據(jù)國標(biāo)鐵礬顯色法[11]，吸取甾醇標(biāo)準(zhǔn)常備液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL分別置于10 mL試管內(nèi)，在各管內(nèi)加入冰乙酸使總體積皆達4 mL。沿管壁加入2 mL鐵礬顯色液，混勻，室溫下顯色15 min后，于最大吸收波長下測定吸光度，每個點重復(fù)3次。以甾醇標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 酯交換植物油中甾醇的測定

取酯交換植物油3～4滴，置于25 mL試管內(nèi)，準(zhǔn)確記錄其重量，65℃恒溫水浴中皂化1 h。冷卻后加入3 mL 5%氯化鈉溶液，10 mL石油醚，振搖2 min，靜置分層。取上層石油醚液2 mL，氮氣吹干后，加入4 mL冰乙酸，2 mL鐵礬顯色液，混勻，放置15 min后在最大吸收波長下比色，測得吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的甾醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 國標(biāo)鐵礬顯色法最大吸收波長的確定

取濃度為2 mg·mL－1的甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品適量，按照國標(biāo)鐵礬顯色法進行處理，并通過分析選擇掃描波長范圍為500～700 nm。采用雙光束紫外可見分光光度計于500～700 nm范圍內(nèi)掃描，在556 nm處有最大吸收峰，因此，選擇556 nm作為測定吸收波長。吸收曲線見圖1。

圖1 植物甾醇的吸收譜Fig.1 Visible absorption spectrum of phytosterol

2.2 國標(biāo)鐵礬顯色法測定甾醇總含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)參考文獻[11]，以甾醇作為標(biāo)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。計算其回歸方程為：Y=0.21001X+0.01216，R2=0.9974。相關(guān)系數(shù)為正，說明吸光值隨甾醇含量增大而增大，其絕對值接近1，兩個變量間的直線相關(guān)密切。曲線回歸性好，可用于定量分析。

2.3 國標(biāo)鐵礬顯色法稀釋倍數(shù)的確定

植物油與甾醇酯交換后，植物油中甾醇的含量較高，不在標(biāo)準(zhǔn)曲線可檢測到的范圍內(nèi)，通過稀釋的方法加以調(diào)整。?

圖2 植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of phytosterol concentration

酯交換植物油中甾醇含量較高，進行顯色處理使用乙酸稀釋，稀釋倍數(shù)為10倍時標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.001，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.09%，為最佳稀釋倍數(shù)。結(jié)果見表1。

2.4 國標(biāo)鐵礬顯色法最優(yōu)顯色條件的確定

選取3個對顯色過程影響較大的因素（即顯色時間、顯色劑用量、顯色劑的組成比例-鐵礬儲備液：濃硫酸）為研究對象，以甾醇含量為考察指標(biāo)進行正交試驗，其因素水平見表2。

2.5 正交試驗設(shè)計

選擇適宜的因素和水平進行正交試驗設(shè)計，分別準(zhǔn)確稱取油樣100.0 mg，改變反應(yīng)的時間、顯色劑用量、顯色劑組成比例3個因素，按照表2給出的因素水平編碼表，以酯交換植物油中甾醇含量為指標(biāo)，進行正交試驗設(shè)計，優(yōu)化顯色反應(yīng)條件。

表1 稀釋倍數(shù)分析結(jié)果Table 1 Influence analysis of dilution multiple on detecting results

表2 因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

2.6 正交試驗結(jié)果分析

由表3可以看出，影響顯色反應(yīng)的因素的主次關(guān)系為：顯色劑用量B＞顯色劑組成比例（C）＞顯色時間A。其中顯色劑用量（B）是影響顯色反應(yīng)的最主要因素。其次，影響顯色反應(yīng)的因素為顯色劑組成比例（C），顯色劑組成中濃硫酸含量較高，操作時應(yīng)注意安全。顯色時間（C）對顯色反應(yīng)也有一定的影響，最佳顯色時間為15 min。通過以上分析可確定最佳反應(yīng)條件為A1B2C1，即顯色劑用量2 mL，顯色劑組成比例1∶9，顯色時間15 min，在最佳反應(yīng)條件下進行驗證試驗，所得甾醇含量為0.0914%。

2.7 國標(biāo)鐵礬顯色法測定植物甾醇總含量

采用國標(biāo)鐵礬顯色法、Lieberman-Burchard比色法和毛地黃皂甙法測定了4種油樣（A高油酸葵花籽油，B大豆油，自制油樣C、D為油樣A、B分別對應(yīng)的高含量甾醇的酯交換植物油），三種方法測得的結(jié)果見表4。由表4可以看出，三種方法的測定結(jié)果的精密度都較高。

表3 正交試驗結(jié)果及分析Table 3 Results and range analysis of orthogonal test

三種方法測定A和B油樣時的平均誤差分別為11.63%、4.85%、5.27%，可見國標(biāo)鐵礬顯色法測定低含量甾醇平均誤差較大，Lieberman-Burchard比色法適用于低含量甾醇的測定；三種方法測定C和D油樣時的平均誤差分別為4.54%、9.00%、4.82%，國標(biāo)鐵礬顯色法測定高含量甾醇的平均相對誤差較小，國標(biāo)鐵礬顯色法適用于酯交換植物油中高含量甾醇的測定。按照國標(biāo)法對植物油進行皂化，對于高含量甾醇酯交換植物油可稀釋后測定，最佳稀釋倍數(shù)為10倍，顯色穩(wěn)定后，在15 min測定吸光值。

2.8 國標(biāo)鐵礬顯色法回收率試驗

采用加樣回收法。取同批酯交換植物油樣品5份約2.2 mg，精密量取濃度為5.0 mg·mL-1甾醇對照品溶液2 mL，分別加入上述5份樣品中。按國標(biāo)鐵礬顯色法處理，加2 mL顯色劑，于最大吸收波長處測定吸光度，計算回收率（見表5）。

表4 三種測定方法的比較分析Table 4 Comparative analysis of three methods （%）

表5 回收率測定結(jié)果Table 5 Result of fortified recoveries

從表5可見，平均回收率為98.61%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.57%，表明加樣回收可滿足要求，本方法測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 討論

a.高含量甾醇的酯交換植物油在油脂領(lǐng)域引起了高度重視和關(guān)注，具有降血脂、防治心血管疾病的功能。本研究嘗試將測定膽固醇的國標(biāo)方法，用來測定酯交換植物油中甾醇的含量，甾醇結(jié)構(gòu)上與膽固醇非常相似，兩者產(chǎn)生顏色反應(yīng)的顯色基團是相同的，以往甾醇的研究方法多由測定膽固醇的方法衍生來。

b.影響顯色反應(yīng)的因素有稀釋倍數(shù)、顯色時間、顯色劑用量、顯色劑的組成比例，其中顯色劑的組成為鐵礬儲備液和濃硫酸，經(jīng)過正交實驗結(jié)果分析得出的最佳顯色劑的組成比例為1∶9，其中濃硫酸濃度較高，在實際操作中需注意。

c.參考不同物質(zhì)中甾醇含量的檢測方法，在國標(biāo)鐵礬顯色法基礎(chǔ)上改進后建立了一種新的快速、準(zhǔn)確的檢測方法，適用于酯交換植物油中高含量甾醇的檢測，并且與另外兩種檢測方法進行了對比分析，分析結(jié)果顯示此方法具有較好精確度和回收率，不需昂貴的標(biāo)準(zhǔn)品，操作簡便快捷，適用于實際研究和產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)監(jiān)測，是一種值得推廣的檢測方法。

4 結(jié)論

以高含量甾醇的酯交換植物油為檢測對象，探索了國標(biāo)鐵礬顯色法、Lieberman-Burchard比色法和毛地黃皂甙法測定酯交換植物油中高含量甾醇的可行性，研究結(jié)果證明Lieberman-Burchard比色法適用于低含量甾醇的植物油的測定。

通過對國標(biāo)鐵礬顯色法（食品中膽固醇測定法）的研究，在此基礎(chǔ)上改進后，可適用于酯交換植物油中高含量甾醇的測定。通過正交試驗得出國標(biāo)鐵礬顯色法最佳顯色條件：顯色劑用量2 mL，顯色劑組成比例1∶9，顯色時間15 min，并試驗得出最佳稀釋倍數(shù)為10倍，平均誤差為4.54%，平均回收率為98.61%。具有較好的精度、準(zhǔn)確性和回收率，操作方法簡便，為酯交換植物油中甾醇含量的測定提供了一種快速而有效的方法。該方法可為添加甾醇功能性油脂的研究提供參考，并可為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供快捷和簡便的監(jiān)測手段。

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