張麗娟

(福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，福建 福州 350002)

有關(guān)蛋白質(zhì)的研究是目前生命科學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)十分活躍的課題[1-2]。尋找新的、無(wú)毒害無(wú)污染、發(fā)光強(qiáng)度高和選擇性強(qiáng)的熒光探針則是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蛋白質(zhì)研究的重要方向。吖啶-4-酰胺衍生物探針在國(guó)內(nèi)外的應(yīng)用研究較少，開(kāi)展這方面的研究對(duì)于拓展吖啶類(lèi)熒光探針的應(yīng)用范圍，開(kāi)發(fā)性能更優(yōu)良的生物大分子熒光探針具有重要意義。在9-氯吖啶-4-甲酰氯的基礎(chǔ)上，同時(shí)在4位、9位上引入2個(gè)N-(2-二甲氨乙基)取代基，合成了具有生物活性的4,9-二[N-(2-二甲氨基)乙基]-9-吖啶胺-4-甲酰胺(簡(jiǎn)寫(xiě)DNAF)。DNAF做為一種新的熒光探針，具有良好親水性和熒光產(chǎn)率；此外，其不含氨基羧基等酸堿基團(tuán)，在酸性體系中，2個(gè)N-(2-二甲氨乙基)取代基具有更高的正電荷，環(huán)境酸堿度變化對(duì)其影響降低。

探索了DNAF對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光猝滅的猝滅機(jī)制，并通過(guò)熒光猝滅試驗(yàn)，研究了DNAF與牛血清白蛋白(簡(jiǎn)寫(xiě)B(tài)SA)的結(jié)合作用機(jī)理。

1　儀器與試劑

Varian Cary Eclipse 熒光光譜儀(美國(guó)VARIAN)；Perkin-Elmer Lambda 800 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó))；PHS-3C型酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司)。

DNAF由實(shí)驗(yàn)室自制，配成3.0×10-4mol/L和1.5×10-4mol/L的儲(chǔ)備液，4 ℃條件下避光保存；牛血清白蛋白(BSA)(Sanland-chem Internation Inc.)配成含0.1 mol/L NaCl的1.0×10-4mol/L的儲(chǔ)備液，存于4 ℃避光條件下；Tris-HCl 緩沖溶液(pH值為7.0)。所用試劑均為生化純與分析純，試驗(yàn)用水均為二次去離子水。

2　試驗(yàn)方法

在一系列5 mL刻度試管中加入pH值為7.0的Tris-HCl緩沖溶液2.0 mL，0.5 mL BSA(1.0×10-4mol/L)溶液，不同體積的DNAF(3.0×10-4mol/L)溶液，用水稀釋至刻度，搖勻，分別在不同溫度下，測(cè)定BSA的熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)290～500 nm，狹縫寬度均為5 nm。

3　結(jié)果與討論

3.1　DNAF對(duì)BSA熒光猝滅的機(jī)理

為了闡明給體BSA的猝滅機(jī)理，固定c(BSA) 為1.0×10-5mol/L,λex為280 nm，pH值為7.0，分別在12、24和36 ℃下，測(cè)定DNAF-BSA體系的熒光光譜。以F0/F為縱坐標(biāo)，c為橫坐標(biāo)作Stern-Volmer圖，見(jiàn)圖1。以(F0-F)-1為縱坐標(biāo)，c-1為橫坐標(biāo)作Lineweaver-Burk圖，見(jiàn)圖2。

圖1　不同溫度條件下BSA與DNAF作用的Stern-Volmer曲線Fig.1　The Stern-Volmer curves of BSA quenched by DNAF at different temperature

由圖1可以看出，隨著溫度的上升，BSA猝滅曲線斜率降低，初步判斷可能為靜態(tài)猝滅。

圖2　不同溫度條件下BSA-DNAF作用Lineweaver-Burk曲線Fig.2　The Lineweaver-Burk curves of BSA-DNAF at different temperature

為了進(jìn)一步證實(shí)此猝滅過(guò)程，利用方程式(1)，將此過(guò)程按動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程處理。

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

式中，F(xiàn)0、F分別為猝滅劑不存在、存在時(shí)的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)，L/(mol·s)；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，L/mol；τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光分子平均壽命，s；[Q]為猝滅劑濃度，mol/L。

熒光分子的平均壽命τ0約為10-8s[3]，故由猝滅曲線斜率可求得12、24和36 ℃時(shí)Kq見(jiàn)表1。

由表1可知，Kq值大于各類(lèi)猝滅劑對(duì)分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)[4]，因此原假設(shè)不成立，猝滅不是由動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程引起的，而是靜態(tài)猝滅過(guò)程。利用靜態(tài)猝滅公式(2)：

表1　BSA與DNAF在不同溫度條件下作用的結(jié)果[按式(1)]Table 1　Experiment results of BSA quenched by DNAF at different temperature(according to eq(1))

1/(F0-F)=1/F0+KD/F0[Q]

(2)

作不同溫度下的Lineweaver-Burk曲線(見(jiàn)圖2)，由直線斜率求得BSA與DNAF在12、24和36 ℃時(shí)的解離常數(shù)KD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　BSA與DNAF在不同溫度條件下作用的結(jié)果[按式(2)]Table 2　Experiment results of BSA quenched by DNAF at different temperature(according to eq(2))

由表2可見(jiàn)溫度對(duì)猝滅的影響不大，說(shuō)明BSA與DNAF有較強(qiáng)的結(jié)合。

3.2　DNAF與BSA作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

圖3為15 ℃時(shí)在牛血清白蛋白溶液體系中，隨著DNAF濃度的增加，BSA的熒光猝滅譜圖。343 nm處為BSA的熒光猝滅情況，451 nm處為在BSA作用下的不同濃度的DNAF的熒光增強(qiáng)情況，c(DNAF)從1到9對(duì)應(yīng)的濃度分別為0、0.4×10-5、0.8×10-5、1.2×10-5、1.6×10-5、2.0×10-5、2.4×10-5、2.8×10-5和3.2×10-5mol/L，c(BSA)為1.0×10-5mol/L。

圖3　溶液中BSA與DNAF相互作用的熒光光譜Fig. 3　Fluorescence spectra of interaction between BSA and DNAF in aqueous solution

(3)

由343 nm處的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步應(yīng)用公式(3)處理，得到圖4。

隨著大數(shù)據(jù)的廣泛應(yīng)用，數(shù)據(jù)挖掘?qū)τ陔娮由虅?wù)的發(fā)展也起著很大影響，利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，可以有效的提高用戶(hù)訪問(wèn)數(shù)量，優(yōu)化網(wǎng)站訪問(wèn)效率，挖掘潛在用戶(hù)、優(yōu)化出售商品性能和提高網(wǎng)站安全環(huán)境等級(jí)等作用。

圖4　lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]作圖Fig.4　The plot of lg[(F0-F)/F] versus lg[Q]

從圖4可以看出，在DNAF由低到高的整個(gè)濃度范圍都呈現(xiàn)良好的線性，與公式(3)吻合良好，表明這一過(guò)程屬于靜態(tài)猝滅過(guò)程。由所得的直線求算出DNAF與BSA結(jié)合時(shí)的結(jié)合常數(shù)KA=5.46×103，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為0.98?？梢?jiàn)DNAF與BSA可發(fā)生相互作用，且結(jié)合作用較強(qiáng)。

3.3　DNAF與蛋白質(zhì)的主要結(jié)合力的確定

在(24±2) ℃下測(cè)定BSA的熒光光譜，當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)焓變可以看作是一個(gè)常數(shù)。根據(jù)公式(4)和(5)：

ln (KA2/KA1)=(1/T1-1/T2)ΔH/R

(4)

ΔG=-RTlnKA=ΔH-TΔS

(5)

可求出24 ℃時(shí)DNAF焓變?chǔ)為-30.35 kJ/mol；熵變?chǔ)為-30.77 J/(mol·K)；反應(yīng)自由能變?chǔ)為-21.21 kJ/mol。由于ΔH<0，ΔS<0，根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)與作用力的關(guān)系，可知DNAF與BSA結(jié)合的作用力類(lèi)型主要是氫鍵與范德華力。

3.4　BSA與DNAF間的能量轉(zhuǎn)移和結(jié)合距離

在一系列5 mL刻度試管中加入pH值為7.0的 Tris-HCl緩沖溶液2.0 mL，空白組加入0.5 mL的BSA(1.0×10-4mol/L)溶液，對(duì)照組加入0.5 mL的BSA(1.0×10-4mol/L)溶液及0.33 mL的DNAF(1.5×10-4mol/L)溶液，使二者物質(zhì)的量之比為1:1。用水稀釋至刻度，搖勻，在15 ℃下測(cè)定空白組和對(duì)照組的熒光光譜，測(cè)定對(duì)照組的紫外吸收光譜。

通過(guò)上述的試驗(yàn)中測(cè)定猝滅速率常數(shù)的結(jié)果，在廣泛的溫度范圍內(nèi)猝滅速率常數(shù)Kq值處于1011L/(mol·s)數(shù)量級(jí)。圖5為n(BSA):n(DNAF)為1:1，c(BSA)為1.0×10-5mol/L,c(DNAF)為1.0×10-5mol/L時(shí)體系的吸收譜和相同濃度的BSA的熒光發(fā)射譜的重疊光譜圖。

圖5　熒光發(fā)射光譜與紫外吸收光譜的譜圖重疊Fig.5　Overlap of the fluorescence emission spectra and absorption spectra

BSA的吸收光譜與發(fā)射光譜有相當(dāng)重疊面積，求得該圖中光譜重疊部分(285～500 nm)的積分面積J為9.73×10-14(cm3·L)/mol，初步判定為遵循F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)制[5]。BSA分子中在134和212位處有2個(gè)色氨酸殘基，BSA熒光(λem=335 nm)主要來(lái)自于第212位的色氨酸殘基。在上述試驗(yàn)條件下，偶極空間取向因子K2可取受供能體各向隨機(jī)分布的平均值2/3[6]，供能體熒光量子產(chǎn)率Φ通常取蛋白質(zhì)中色氨酸的量子產(chǎn)率0.118[7]，介質(zhì)折射指數(shù)N一般取水和有機(jī)物折射指數(shù)的平均值1.336[8]。據(jù)公式(6)和(7)，可計(jì)算相關(guān)信息。

式中，R0為臨界距離，nm；K2為偶極空間取向因子；N為介質(zhì)的折射指數(shù)；Φ為授體的光量子效率；J為授體(蛋白質(zhì))熒光發(fā)射光譜與受體(染料)吸收光譜間的光譜重疊積分，cm3·L/mol；E為能量轉(zhuǎn)移效率；r為授體-受體間距離，nm。

分別求得臨界距離R0為3.58 nm；能量轉(zhuǎn)移效率E為0.12；從而求出BSA中第212位色氨酸殘基與DNAF分子間的距離r為4.99 nm。

4　結(jié)論

利用合成的一種新型的蛋白質(zhì)分子熒光探針DNAF，對(duì)其與BSA的相互作用進(jìn)行了研究。得知DNAF對(duì)BSA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅機(jī)制，測(cè)定了相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔH為-30.35 kJ/mol，ΔG為-21.21 kJ/mol，ΔS為-30.77 J/(mol·K)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為0.98及表觀結(jié)合常數(shù)KA為5.46×103，計(jì)算了供體BSA和受體DNAF的距離r為4.99 nm，能量轉(zhuǎn)移效率E為0.12。證明氫鍵作用和范德華力對(duì)兩者結(jié)合起到重要作用，DNAF與BSA的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制符合F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論。

參考文獻(xiàn)：

[1]王夔，邰子厚，徐輝碧. 生物無(wú)機(jī)化學(xué)[M]. 北京：清華大學(xué)出版社，1988

[2]KRAGH H U. Molecular aspects of ligand binding to serum album[J]. Pharmacol Review, 1981，33(1): 17-53

[3]易平貴，劉俊峰，陳安國(guó). 熒光法研究吖啶橙與牛血清白蛋白結(jié)合作用的機(jī)理[J]. 湘潭礦業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，15(4)：56-59

[4]楊頻，高飛. 生物無(wú)機(jī)化學(xué)原理[M]. 北京：科學(xué)出版社，2002

[5]LAKOWICZ R J. Principles of Fluorescence Spectroscopy[M]. New York：Plenum Press, 1983

[6]CALTAGIRONE S, ROSSI C, POGGI A,etal. Flavonoids apigenin and quercet in inhibit melanoma growth and metastatic potential[J]. Int J Cancer, 2000, 87: 595-600

[7]CYRIL L,EARL J K,SPERRY W M.Biochemists Handbook[M].London:E & FN Epon Led Press,1961

[8]YANG P, YANG M, YANG B. Fluorescence enhancement effect and the interaction between donor and acceptor[J]. Chinese J Chem, 1996, 14(2): 109-113