朱益波，翟麗君，朱 明，齊 斌,*

(1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.大富豪(常熟)啤酒有限公司，江蘇 常熟 215500)

啤酒廢酵母中β-D-葡聚糖非降解提取工藝

朱益波1，翟麗君1，朱 明2，齊 斌1,*

(1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.大富豪(常熟)啤酒有限公司，江蘇 常熟 215500)

采用單因素及正交試驗研究新型非降解法提取廢啤酒酵母β-D-葡聚糖工藝。該工藝主要包括誘導(dǎo)自溶、熱水浸提、破壁、脫脂、蛋白酶處理等過程。結(jié)果表明，提取物中總糖質(zhì)量百分含量為84.9%，得率為13.7%。與已有報道相比具備較高的純度和得率。誘導(dǎo)自溶及熱水浸提處理對于提取物的得率和純度具有重要影響，蛋白酶處理對于進一步減少蛋白質(zhì)含量和提高產(chǎn)物純度也有顯著作用。整個提取過程沒有采用強酸、堿和氧化劑有助于保護產(chǎn)物的生理活性和環(huán)境。

廢啤酒酵母；β-D-葡聚糖；非降解提取

近二十年來，國內(nèi)的啤酒工業(yè)發(fā)展迅速，已經(jīng)連續(xù)8年蟬聯(lián)世界產(chǎn)量第一。有數(shù)據(jù)表明2010年1～11月份全國啤酒總產(chǎn)量已經(jīng)達到近4240萬噸，其中江蘇省同期的產(chǎn)量達到250萬噸，在全國30個主要啤酒生產(chǎn)省市中位列第5位。按照每噸啤酒產(chǎn)生1.5kg廢酵母(干質(zhì)量)計算[1]，全國每年產(chǎn)生約6.36萬噸廢啤酒酵母。目前，對于廢啤酒酵母的綜合利用主要集中在酵母細胞的氨基酸、肽、蛋白資源，酵母抽提物調(diào)味品，β-葡聚糖、甘露糖以及活性酶類如超氧化物歧化酶等產(chǎn)品的生產(chǎn)與研究[2]。大量研究表明β-D-葡聚糖通過結(jié)合巨噬細胞特異性受體使其激活，加強了宿主的抵御能力進而表現(xiàn)出抗腫瘤、抗菌，促進傷口愈合以及免疫調(diào)節(jié)活性[3-5]。酵母細胞壁中主要成分包括甘露糖肽和β-D-葡聚糖，分別占細胞壁干物質(zhì)量的40%和60%。因此，大量的廢啤酒酵母成為制備β-D-葡聚糖的首選。但是β-D-葡聚糖的分離技術(shù)主要是基于早先開發(fā)的酸-堿提取法以及次氯酸鈉細胞直接氧化法。這些方法會使大量葡聚糖降解，降低葡聚糖的得率并且顯著影響生物學(xué)功能[5-6]。因此基于溫和提取及酶處理的非降解工藝研究正逐步展開[7-8]。本研究旨在廢啤酒酵母自溶的基礎(chǔ)上研究新型β-D-葡聚糖非降解工藝，為廢啤酒酵母的進一步綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廢啤酒酵母 大富豪啤酒(常熟)有限公司；中性蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；IKA-T18高速分散機 德國IKA公司；Alpha1-2真空冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

廢酵母→洗滌→誘導(dǎo)自溶→熱水浸提→破壁→脫脂→蛋白酶處理→冷凍干燥→葡聚糖

1.3.2 分析方法

粗蛋白含量測定：采用凱氏定氮法；可溶性蛋白含量測定：采用福林酚法；總脂肪含量測定：采用索式抽提法；總糖的測定：采用苯酚-硫酸法，以總糖的百分含量表示提取物中β-D-葡聚糖的相對純度；游離α-氨基氮含量測定：采用甲醛滴定法；細胞破壁率及自溶率測定：采用文獻[8]方法。

1.3.3 洗滌

廢啤酒酵母經(jīng)5% Na2CO3洗滌3遍，再用蒸餾水洗1遍，然后4000r/min離心5min，取沉淀。

1.3.4 誘導(dǎo)自溶單因素試驗及正交優(yōu)化

分別以pH值、NaCl質(zhì)量分數(shù)、菌體質(zhì)量濃度以及誘導(dǎo)溫度進行單因素試驗，并根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)定各因素水平，設(shè)計L9(34)正交試驗。自溶結(jié)束后80℃保持15min滅酶，離心洗滌自溶細胞并保存于4℃，并分別取樣測定自溶液中游離α-氨基氮含量，計算游離α-氨基氮得率。

1.3.5 熱水浸提

將自溶酵母細胞懸浮于50mmol/L pH7.5磷酸緩沖液中至終質(zhì)量濃度100g/L，121℃處理6h，待降至室溫后離心洗滌，沉淀保存于4℃。

1.3.6 細胞破壁單因素試驗及正交優(yōu)化

熱水浸提處理后的細胞懸浮于磷酸緩沖液，分別以轉(zhuǎn)速、時間和質(zhì)量分數(shù)為單因素，進行高速分散機破壁處理，根據(jù)單因素試驗結(jié)果選擇各因素水平進行正交試驗優(yōu)化。

1.3.7 脫脂

取破壁后酵母細胞按1:4(g/mL)與丙酮配成懸液，水浴回流2h，離心收集上清，沉淀再用丙酮按1:1(g/mL)的比例洗滌3次，離心收集沉淀得到脫脂細胞壁。

1.3.8 蛋白酶處理

脫脂細胞壁懸浮于磷酸緩沖液至終濃度質(zhì)量150g/L，在酵母(濕質(zhì)量)中以每克酵母添加10000U的比例加入中性蛋白酶，并于55℃酶解5h，然后加熱至80℃保溫15min，離心洗滌直至上清液不含可溶性蛋白，沉淀即為含酵母細胞壁提取物。

1.3.9 真空冷凍干燥

將1.3.8節(jié)所得提取物置于冷阱中預(yù)凍6h，抽真空過夜冷凍干燥，4℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)自溶單因素試驗及正交優(yōu)化分析

圖1 誘導(dǎo)自溶單因素試驗結(jié)果Fig.1 Effects of temperature, pH, [NaCl] and cell density on induced yeast autolysis

圖1表明溫度、NaCl質(zhì)量分數(shù)以及pH值對于誘導(dǎo)自溶影響較大，55℃誘導(dǎo)自溶游離氨基酸得率約是40℃條件下的3倍，3% NaCl的添加明顯提高了氨基氮得率，而pH5.5自溶效果則是pH8.0的1.7倍。選擇誘導(dǎo)溫度50、55、60℃；NaCl質(zhì)量分數(shù)1%、2%、3%；pH4.0、5.0、6.0；菌體質(zhì)量濃度50、100、150g/L進行正交優(yōu)化。正交優(yōu)化結(jié)果(表1)表明誘導(dǎo)pH值、NaCl質(zhì)量分數(shù)以及溫度對于自溶程度具有較大的影響。雖然NaCl質(zhì)量分數(shù)2%和3%對應(yīng)的實驗結(jié)果是一致的，但考慮到誘導(dǎo)自溶時間較長，3% N aCl質(zhì)量分數(shù)更利于抑制雜菌的生長，所以選擇3% NaCl自溶更為合適。菌體質(zhì)量濃度對于實驗結(jié)果影響很小，故選擇150g/L菌懸液為優(yōu)化結(jié)果進行后續(xù)試驗。綜上所述誘導(dǎo)自溶優(yōu)化后最適條件分別為pH5.0、3% N aCl、溫度55℃、菌體質(zhì)量濃度150g/L。

表1 誘導(dǎo)自溶正交試驗結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimization of induced yeast autolysis

2.2 廢酵母自溶過程中游離α-氨基氮及可溶性蛋白含量變化

酵母誘導(dǎo)自溶過程實質(zhì)是細胞內(nèi)多種水解酶作用于胞內(nèi)物質(zhì)，最終將其降解成小分子質(zhì)量產(chǎn)物。該過程主要涉及到如磷酸酯酶、核糖核酸酶以及蛋白酶等水解酶類，這些酶原在特定條件下被激活，進而作用于相應(yīng)底物，胞內(nèi)的生物大分子被降解后積累于胞內(nèi)，當(dāng)被水解為能通過細胞壁的小分子時，水解產(chǎn)物則釋放到胞外。水解酶同時也發(fā)生自身消化，水解活性隨之降低，自溶作用逐漸停止[9]。本研究在優(yōu)化了誘導(dǎo)自溶條件后，考查了廢酵母細胞誘導(dǎo)自溶過程中游離α-氨基氮及可溶性蛋白的動力學(xué)變化規(guī)律(圖2)。

游離α-氨基氮及可溶性蛋白在誘導(dǎo)自溶過程中表現(xiàn)出一致的動力學(xué)過程：在誘導(dǎo)自溶的前20h，游離α-氨基氮及可溶性蛋白的濃度持續(xù)上升，其中前12h的增長速度最高，12～20h逐漸減慢，20h以后濃度基本保持穩(wěn)定狀態(tài)。結(jié)果表明胞內(nèi)蛋白在多種蛋白酶的作用下迅速被降解成肽及氨基酸等小分子物質(zhì)，并很快釋放至胞外；可溶性蛋白及游離α-氨基氮表現(xiàn)出一致的動力學(xué)曲線表明游離氨基酸和可溶性蛋白同時釋放到胞外，這一現(xiàn)象可能暗示除了蛋白質(zhì)發(fā)生了迅速的降解外，細胞壁和細胞膜也發(fā)生了較大的變化，以利于自溶物的迅速釋放；24h誘導(dǎo)自溶后，可溶性蛋白含量達到穩(wěn)定值，表明在該優(yōu)化條件下經(jīng)24h自溶已經(jīng)達到穩(wěn)定狀態(tài)，此時酵母細胞的自溶率為46%，故24h可以作為自溶作用的最適時間。

圖2 廢酵母自溶過程曲線Fig.2 Time courses of induced spent yeast autolysis in term ofαamino nitrogen and soluble protein contents in supernatant

2.3 細胞破壁

圖3 時間(a)、轉(zhuǎn)速(b)和菌體質(zhì)量濃度(c)對細胞破壁率的影響Fig.3 Effects of duration, speed and cell density on percentage of disrupted cells

細胞破壁單因素試驗結(jié)果(圖3)表明破壁時間、轉(zhuǎn)速以及菌體質(zhì)量濃度對于破壁效果都有明顯影響。綜合圖中結(jié)果選擇破壁時間1、2、3min；轉(zhuǎn)速12000、15000、18000r/min；菌體質(zhì)量濃度50、100、150g/L進行正交優(yōu)化。研究已經(jīng)表明熱水處理后的酵母細胞壁機械強度要遠低于新鮮酵母細胞壁機械強度[8]。這可能是由于酵母細胞經(jīng)熱水處理后，細胞壁中大量的甘露糖蛋白被去除，從而降低了細胞壁的機械強度，提高了細胞壁的滲透性。該研究考查了在熱水處理后高速分散機破壁的效果(表2)，結(jié)果表明采用高速分散機破壁，轉(zhuǎn)速和處理時間對破壁率有主要影響。各因素對破壁率影響的大小為轉(zhuǎn)速＞時間＞菌體質(zhì)量濃度。最佳條件為轉(zhuǎn)速15000r/min、100g/L菌體質(zhì)量濃度處理3min，破壁率達到95.5%。

表2 破壁正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimization of cell wall disruption

2.4 提取物成分分析

圖4 提取物成分變化分析Fig.4 Physic-chemical analysis of extract

廢啤酒酵母細胞經(jīng)上述各項處理后，提取物的成分見圖4所示。經(jīng)自溶處理后，提取物中粗蛋白質(zhì)量百分含量與酵母細胞相比下降約60%，熱水處理后粗蛋白含量又進一步下降約50%，最終經(jīng)蛋白酶處理后粗蛋白質(zhì)量百分含量是2.2%，僅有酵母細胞粗蛋白含量的5%。經(jīng)各項處理后，總糖質(zhì)量百分含量基本呈現(xiàn)逐步上升的趨勢：自溶后與原細胞相比，上升了約70%；熱水處理后進一步上升約30%，進一步經(jīng)脫脂和蛋白酶處理后最終總糖質(zhì)量百分含量達到84.9%，相比酵母細胞的33.4%提高了154%；脂肪含量的變化表明在脫脂處理之前，總脂肪含量約為3%～5%之間，脫脂后脂肪含量下降到0.68%；各提取過程的固體質(zhì)量(干質(zhì)量)表明：自溶過程對于細胞物質(zhì)量的減少最為顯著，經(jīng)自溶后質(zhì)量減少了42.5%，這與約46%的自溶率較為一致，熱水處理后物質(zhì)量減少了39.5%，進一步經(jīng)過脫脂處理和蛋白酶處理后，相對于酵母細胞，產(chǎn)品最終得率約為13.7%。

上述結(jié)果可以看出，粗蛋白隨著提取過程而逐漸下降，總糖含量逐漸上升。其中酵母自溶和熱水處理對粗蛋白的去除和總糖含量的提升最為明顯。因此酵母自溶和熱水處理對于該提取工藝具有重要影響。通過誘導(dǎo)自溶作用不僅可以釋放大量的胞內(nèi)物質(zhì)，也可能促進了細胞膜和細胞壁成分向有助于提取β-D-葡聚糖的轉(zhuǎn)變。熱水處理后，大量甘露糖蛋白得以去除。有資料表明通過自溶和熱水處理可以去除約83%的甘露糖蛋白，而其中89%是通過熱水過程處理去除，這使得粗蛋白含量進一步明顯下降，總糖百分含量進一步上升[8]。蛋白酶處理結(jié)果表明，蛋白酶能夠進一步減少提取物中蛋白質(zhì)含量，這可能是蛋白酶降解了細胞壁中殘存的甘露糖蛋白，從而導(dǎo)致粗蛋白含量的降低。

2.5 不同提取方法結(jié)果比較

表3 不同提取方法結(jié)果比較Table 3 Comparison among different extraction methods on total sugar content and yield of extracts

本方法參考自溶-熱水-酶解法提取廢啤酒酵母細胞葡聚糖，工藝過程中沒有采用酸、堿、氧化等較為強烈的處理方法，從而可有效避免葡聚糖的降解以及其結(jié)構(gòu)的改變。由表3可知，與其他方法相比，本方法得率相對較高，總糖的含量也高于酶堿法和自溶酶堿法。

3 結(jié) 論

本研究在已有報道的基礎(chǔ)上提出了非降解法提取廢啤酒酵母細胞中β-D-葡聚糖的方法。結(jié)果表明廢啤酒酵母經(jīng)過洗滌、誘導(dǎo)自溶、熱水浸提、破壁、脫脂、蛋白酶處理后總糖含量可以達到84.9%，最終得率為13.7%。該方法摒棄了傳統(tǒng)的酸、堿及氧化劑的使用，不僅獲得了較高的產(chǎn)品得率和總糖含量，而且有助于保持產(chǎn)品的原有結(jié)構(gòu)、生理活性以及環(huán)境保護。為更好地綜合利用大量廢啤酒酵母提出了一個新的方法和參考。但是該方法與其他方法相比處理過程較為復(fù)雜，欲在實際中應(yīng)用還需要將提取過程進一步整合和優(yōu)化，比如縮短誘導(dǎo)自溶時間，采用新的方法和設(shè)備將細胞熱水浸提甘露糖與破壁同時處理，以減少處理程序和成本，進一步提高產(chǎn)品純度和得率。

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A Novel Method for Non-degradative Extraction of β-D-Glucans from Spent Yeast Cells

ZHU Yi-bo1，ZHAI Li-jun1，ZHU Ming2，QI Bin1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering , Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China；2. Dafuhao Brewery (Changshu) Co. Ltd., Changshu 215500, China)

We here present a novel method to extract non-degraded β-D-glucans from spent yeast cells, mainly based on induced yeast autolysis, hot water extraction, cell wall disruption, defatting and protease hydrolysis. One-factor-at-a-time coupled with orthogonal array design method was applied to the process conditions of induced yeast autolysis and cell wall disruption. The extract obtained under optimized conditions had a total sugar content of 84.9% with an extraction yield of 13.7%. Its purity and yield were both higher than previously reported. Induced yeast autolysis and hot water extraction had a significant effect on β-D-glucan purity and yield. Moreover, protease treatment could further remove protein impurities and increase β-D-glucan purity. The absence of strong acid, strong alkali and oxidant throughout the process helped to protect the physiological activity of products and the environment.

spent yeast cell；β-D-glucans；non-degradative extraction

TS261.9

：A

1002-6630(2011)20-0121-05

2011-07-05

江蘇省高校自然科學(xué)研究計劃項目(08KJD180006)

朱益波(1980—)，男，講師，博士研究生，研究方向為基因工程與發(fā)酵工程。E-mail：centuryrain@126.com

*通信作者：齊斌(1965—)，男，教授，博士后，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：qibin65@126.com