許 偉，仇 明，余曉紅，封功能，邵 榮

(鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

芽孢桿菌植酸酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

許 偉，仇 明，余曉紅，封功能，邵 榮

(鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

采用PCR技術(shù)從Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061中克隆到植酸酶的全長基因phyC(1152bp)，并將該基因成功克隆到表達載體pET22b(+)，經(jīng)PCR鑒定和DNA測序證明，pET22b(+)-phyC重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將該酶的氨基酸序列在Swiss-prot數(shù)據(jù)中進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該序列未見報道，其與來自Bacillus subtilis的植酸酶序列(Swiss-prot ID: O31097)最相似，序列一致性為98.7%。分析可知該氨基酸序列在位點為128、144、153、257和370處分別變異為Ala、Ile、Ser、Pro和Lys。運用SignalP 3.0服務(wù)器對其信號肽進行預(yù)測，表明該酶N端1～26個殘基可能是信號肽序列。運用SWISS-MODEL服務(wù)器進行同源建模，經(jīng)PROCHECK V3.5軟件對其Ramachandran plot、G-factor等進行評價，結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)模型中的鍵長、鍵角及二面角的分布及結(jié)構(gòu)合理。該基因已在GenBank上登錄(登錄號為HM747163)。

植酸酶基因；克隆；同源建模

植酸酶(phytase)即肌醇六磷酸酶(myo-inositol hexaphoshate phosphohydrotase)是催化植酸及其植酸鹽水解產(chǎn)生肌醇和磷酸(或者磷酸鹽)這類酶的總稱[1]。它是一種新型、綠色環(huán)保的飼料用酶，對于提高飼料中磷的利用率，提高機體對蛋白質(zhì)及多種微量元素的利用率及減輕因動物高磷糞便所導(dǎo)致的環(huán)境污染有著極其重要的意義。然而，目前對于植酸酶制劑的研發(fā)主要集中在酸性植酸酶上，僅適合胃中pH值呈酸性的單胃動物以及少數(shù)魚類如虹鱒等，不適用于我國水產(chǎn)養(yǎng)殖量最大的消化道為中性的鯉科魚類。來源于芽孢桿菌的植酸酶屬于中性植酸酶，其可在pH值為中性的腸道中起作用，有效彌補了傳統(tǒng)酸性植酸酶的不足，拓寬了植酸酶的應(yīng)用范圍[2-3]。由于野生微生物菌株的產(chǎn)酶水平較低，制約了中性植酸酶在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用，因此提高菌株植酸酶的產(chǎn)酶水平是實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵[4-5]。

當(dāng)前，國內(nèi)外關(guān)于中性植酸酶的研究主要集中于產(chǎn)酶菌篩選和基因工程菌的構(gòu)建方面[6-8]。2001年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所和生物技術(shù)研究所合作，從枯草芽孢桿菌中提取中性植酸酶，獲得初步成功[9]。姚斌等[10]進一步對此菌株進行了克隆并在大腸桿菌中表達。Kim等[11]用帶有誘導(dǎo)型T7啟動子的pET22b(+)質(zhì)粒，在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)3h，表達量為出發(fā)菌株的50倍，并證明乳糖是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的誘導(dǎo)劑。陳艷等[12]將來源于淀粉液化芽孢桿菌的植酸酶在大腸桿菌中進行了表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：重組酶最適pH值為7.5，最適溫度為70℃，植酸鈉為底物的Km值為0.32mmol/L，單位發(fā)酵液工程菌的植酸酶活性為出發(fā)菌株的1.27倍。李朝霞等[13]從自然界中篩選到高產(chǎn)中性植酸酶的地衣芽孢桿菌，并對其產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件進行了研究。目前已分離出多種產(chǎn)中性植酸酶的微生物主要包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌及其他菌株等[14]。研究人員運用基因工程手段在植酸酶熱穩(wěn)定性改造方面也進行了較多的研究[15-17]。本實驗從Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061的中克隆到新的植酸酶基因，并對其進行同源建模及分析，以期為中性植酸酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061) 德國DSMZ菌種保藏中心；表達載體質(zhì)粒pET22b (＋)、E.coil DH5α為實驗室保存。

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ、DNA Marker (DL2000) 日本Takara公司；Ready-to-easy PCR反應(yīng)試劑盒、快速連接試劑盒、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、EZ-10質(zhì)粒提取試劑盒及氨芐青霉素 生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，完全溶解于950mL去離子水中，以5mmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH7.0，定容至1L，121℃高壓蒸汽滅菌20min。基因工程菌在培養(yǎng)前加入氨芐青霉素至終質(zhì)量濃度100μg/mL。LB固體培養(yǎng)基即在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。

1.4 方法

1.4.1 Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061的培養(yǎng)

裝有30mL LB液體培養(yǎng)基錐形瓶(250mL)，經(jīng)高溫蒸汽滅菌(121℃，20min)并冷卻，按接種量體積分?jǐn)?shù)1%接種300μL已經(jīng)活化的菌種至培養(yǎng)基中，置搖床中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度30℃，轉(zhuǎn)速150～160r/min，培養(yǎng)過夜。

1.4.2 分子克隆操作方法

DNA酶切、連接、轉(zhuǎn)化和細菌感受態(tài)制備等基本基因操作技術(shù)參照文獻[18]及有關(guān)公司提供的操作手冊進行。采用CaCl2法制備E. coli DH5α的感受態(tài)細胞，采用42℃熱休克方法進行轉(zhuǎn)化。取對數(shù)期B. amyloliquefaciens DSM 1061細胞，采用改良的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA[18]。采用生工生物工程(上海)有限公司的膠回收試劑盒將目的基因片段進行純化，并運用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒。

1.4.3 植酸酶基因phyC的擴增及表達質(zhì)粒的構(gòu)建

參考GenBank報道的Bacillus amyloliquefaciens植酸酶基因(AY055220)，采用Primer Premier 5.0 設(shè)計引物。在引物中分別引入限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ(加粗下劃線部分)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物如下：phyC-F：5＇-GCGGATCCATGAATCATTC AAAAACAC-3＇，phyC-R：5＇-GTCAAGCTTTTAT TTTCCGCTTCTGTC-3＇。

以提取的基因組為模板，采用生工生物工程公司的PCR試劑盒進行擴增。PCR的反應(yīng)參數(shù)為：94℃，1min；56℃，1min；72℃，1min；共進行36個循環(huán)。擴增產(chǎn)物采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將PCR產(chǎn)物和pET22b(+)載體分別用BamHⅠ和HindⅢ消化并連接，構(gòu)建質(zhì)粒pET22b(+)-phyC。連接液轉(zhuǎn)化DH5α細胞，對陽性克隆進行PCR鑒定，提取質(zhì)粒并送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

1.4.4 植酸酶序列的生物信息學(xué)分析

蛋白質(zhì)序列比對及分析采用軟件ClustalX 1.83和Vector NTI 8.0，三維結(jié)構(gòu)顯示使用Rasmol 2.7[19]和DeepView3.7軟件。運用蛋白質(zhì)組服務(wù)器(http://expasy. org/tools/)中的Signal P 3.0工具對其信號肽進行預(yù)測，選用其中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法，預(yù)測范圍設(shè)置為革蘭氏陽性菌，N-端70個氨基酸殘基；對刪除信號肽部分的中性植酸酶(353氨基酸殘基)運用SWISS-MODEL服務(wù)器進行同源建模，采用晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 2POO)為模板[20]；運用軟件PROCHECK V3.5對同源模型的Ramachandran plot、G-factor進行分析，并運用PDBsum數(shù)據(jù)庫中的二級結(jié)構(gòu)分析模塊(secondary structure)對模型的二級結(jié)構(gòu)進行分析。以上軟件中參數(shù)設(shè)置非特殊說明均采用軟件默認值。

2 結(jié)果與分析

2.1 中性植酸酶基因的克隆及表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以B.amyloliquefaciens DSM 1061基因組DNA為模板，加入合成好的引物進行PCR反應(yīng)擴增目的基因。PCR的擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結(jié)果見圖1。PCR產(chǎn)物為單一條帶約為1.1kbp，對應(yīng)片段大小與預(yù)期相符合。將PCR產(chǎn)物和pET22b(＋)載體分別用BamHⅠ和HindⅢ消化并連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET22b(＋)-phyC(圖2)。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。然后挑選陽性克隆并提取質(zhì)粒DNA，PCR鑒定表明基因phyC已準(zhǔn)確地克隆到pET22b(＋)表達載體。

圖1 植酸酶基因(phyC)PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 Agarose gel electrophoregram of PCR products of phyC

圖2 重組表達質(zhì)粒pET22b(+)-phyC構(gòu)建圖譜Fig.2 Physical map of recombinant expression plasmid pET22b(+)-phyC

2.2 植酸酶基因phyC的DNA測序及其生物信息學(xué)分析

2.2.1 植酸酶氨基酸序列的比對分析

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的BLASTp將所克隆的植酸酶翻譯的蛋白質(zhì)序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列比對，發(fā)現(xiàn)其與來自Bacillus subtilis (Swiss-prot ID: O31097 )的植酸酶序列最相似，序列一致性為98.7%。運用Vector NTI 8.0軟件對所克隆到的中性植酸酶與O31097進行比對分析，結(jié)果見表1。研究所獲得的植酸酶序列其在氨基酸殘基位點為128、144、153、257和370處分別變異為Ala、Ile、Ser、Pro和Lys。

表1 獲得的植酸酶與來自B. subtilis (Swiss-prot ID: O31097 )的殘基差異Table 1 Different residues of the phytase compared with those of B. subtilis

2.2.2 植酸酶信號肽預(yù)測

圖3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法預(yù)測植酸酶信號肽結(jié)果Fig.3 Prediction of signal peptides of phytase based on neural networks

運用Signal P 3.0對已經(jīng)獲得的中性植酸酶從N端開始的70個氨基酸殘基進行信號肽分析(圖3)，其中在蛋白質(zhì)序列的N端1～26個氨基酸殘基的S值較高，說明該部分可能是中性植酸酶的信號肽序列。其中，在26位和27位左右Y值和C值達到最高，預(yù)測信號肽剪切位點在SQA-KH，在N端26位后進行剪切，其中27位可能是成熟蛋白質(zhì)部分。

2.2.3 植酸酶同源建模與評價

圖4 植酸酶同源建模結(jié)構(gòu)及突變殘基(a)植酸酶的同源模型(b)殘基突變的空間位置Fig.4 Mutation position and homology structure of phytase (a) homology structure of phytase (b) The position of mutant residues

運用SWISS-MODEL服務(wù)器(http://swissmodel. expasy.org/)，對刪除信號肽部分的中性植酸酶(353個氨基酸殘基)進行同源建模。服務(wù)器基于序列相似性對建模模板進行篩選，采用與實驗中獲得的植酸酶序列相似性為93.768%并且來自于Bacillus amyloliquefaciens的植酸酶晶體結(jié)構(gòu)為模板(PDB ID:2POO，分辨率為2.05A)。通過去除HET基團，對初始比對序列進行精加工，進行簡單骨架分配、加側(cè)鏈、加氫等過程對模型進行構(gòu)建，經(jīng)結(jié)構(gòu)與能量優(yōu)化后最終模型總能量為-17062.795kJ/mol (圖4a)。圖4b中標(biāo)出了該酶與B. subtilis (Swiss-prot ID: O31097 )相比，變異殘基在空間結(jié)構(gòu)中的位置。

圖5 植酸酶同源模型的Ramachandran圖Fig.5 Ramachandran plot of homology structure of phytase

圖6 植酸酶同源模型的二級結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Secondary structure of homology structure of phytase

運用PROCHECK V3.5對同源模型的Ramachandran plot、G-factor進行分析。圖5根據(jù)蛋白質(zhì)中非鍵合原子間的最小接觸距離，確定哪些成對雙面角(φ和ψ)所規(guī)定的兩個相鄰肽單位的構(gòu)象是允許的，哪些是不允許的，并且以φ為橫坐標(biāo)，以ψ為縱坐標(biāo)作圖。在進行同源建模的353個氨基酸殘基中，除Gly和Pro以外的300個氨基酸殘基，有249個處于最許可區(qū)域，占83%；有50個處于額外許可區(qū)域，占16.7%；有1個處于普遍許可區(qū)域(在圖中標(biāo)注的Asp27)，占0.3%。在這300個殘基中沒有位于不許可區(qū)域的，其中位于最許可區(qū)和額外許可區(qū)的占99.7%，說明模型的主鏈和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)合理。運用PROCHECK檢查植酸酶的同源模型得到二面角和主鏈共價作用力的G-factors平均值分別為-0.24和0.35，說明模型的各項指標(biāo)在對應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)范圍內(nèi)。

運用PDBsum工具中的二級結(jié)構(gòu)分析模塊對植酸酶同源模型的二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果如圖6所示。植酸酶模型二級結(jié)構(gòu)由7個片層、17個β發(fā)夾，20個β突起，27條β鏈、7個螺旋，36個β轉(zhuǎn)角，4個γ轉(zhuǎn)角組成。

3 結(jié) 論

中性植酸酶作為一種新型綠色飼料添加劑，在推廣應(yīng)用上具有極其廣闊的空間。本研究運用基因工程技術(shù)獲得了B. amyloliquefaciens DSM1061植酸酶的全長基因phyC，經(jīng)Swiss-prot數(shù)據(jù)中進行BLAST比對可知該酶為新型的中性植酸酶(GenBank：HM747163)。將該基因成功構(gòu)建到大腸桿菌表達質(zhì)粒pET22b(+)上，目前課題組正在開展相關(guān)的表達及蛋白純化工作。

本研究所獲得的中性植酸酶氨基酸序列與來自B. subtilis的植酸酶序列(Swiss-prot ID: O31097)最相似，序列一致性為98.7%，其在氨基酸位點為128、144、153、257和370處分別變異為Ala、Ile、Ser、Pro和Lys。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的差異性及生物功能的多樣性的基礎(chǔ)，推測以上5個氨基酸殘基位點的變異，有可能會導(dǎo)致該酶具有與已經(jīng)報道的中性植酸酶不同的性質(zhì)及催化特點。同時，與其他中性植酸酶類似，本研究中獲得的植酸酶的N端1～26個殘基可能是信號肽序列，獲得的中性植酸酶進行了同源建模及評價，結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)模型中的鍵長、鍵角及二面角的分布及結(jié)構(gòu)合理。研究結(jié)果進一步豐富了中性植酸酶的序列及結(jié)構(gòu)信息，為進一步深入理解中性植酸酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供參考，同時也為中性植酸酶的高效表達及開發(fā)應(yīng)用提供參考。

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Gene Cloning and Bioinformatics Analysis of Phytase from Bacillus amyloliquefaciens

XU Wei，QIU Ming，YU Xiao-hong，F(xiàn)ENG Gong-neng，SHAO Rong
(College of Chemical and Biological Engineering, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224051, China)

The full-length DNA sequence of neutral phytase gene was cloned from Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 by PCR, and successfully inserted into the expression vector pET22b(+). The results were identified by PCR and DNA sequencing. Based on Blast alignment, it was found that the amino acid sequence of the enzyme has never been reported the Swiss-prot database. Its amino acids sequence showed 98.7% identity with that of Bacillus subtilis (Swiss-prot ID: O31097). The residues 128, 144, 153, 257 and 370 are replaced by Ala, Ile, Ser, Pro and Lys, respectively. The N-terminal residues 1—26 were predicted to be a signal peptide by Signal P 3.0 Server. The homology modeling of the new phytase was constructed using SWISSMODEL. The software PROCHECK V3.5 was used to evaluate the model according to Ramachandran plot and G-factor. The results showed that the bond length, bond angle, the distribution of dihedral angle and structure were rational. The gene sequence has been submitted to the NCBI GenBank and the accession number is HM 747163.

phytase gene；cloning；homology modeling

Q812

A

1002-6630(2011)07-0202-05

2010-08-04

江蘇省普通高校自然科學(xué)研究資助項目(09KJB530011)

許偉(1976—)，女，副教授，博士，研究方向為酶工程。E-mail：ycitxuwei@ycit.edu.cn