何秋彤，余以剛*，李聰聰，李經(jīng)桐，吳 暉

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

20種市售涼茶類植物飲料抗氧化性的比較研究

何秋彤，余以剛*，李聰聰，李經(jīng)桐，吳 暉

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

利用DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、ORAC法和Fe3+還原能力實(shí)驗(yàn)，考察20種市售涼茶類植物飲料的抗氧化性。結(jié)果表明：20種涼茶在不同的抗氧化評(píng)價(jià)體系中均表現(xiàn)出不同程度的抗氧化能力。運(yùn)用模糊評(píng)價(jià)理論建立的抗氧化綜合評(píng)價(jià)模型表明，抗氧化綜合評(píng)價(jià)值最高的5種涼茶類植物飲料皆為傳統(tǒng)涼茶鋪出售的涼茶。各涼茶試樣的抗氧化綜合評(píng)價(jià)值與總酚含量有一定的相關(guān)性，但線性關(guān)系不顯著。

抗氧化性；涼茶；總酚含量；黃酮含量；模糊綜合評(píng)價(jià)

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，現(xiàn)已證明自由基和活性氧對(duì)人體組織的損傷與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]，如：炎癥、腫瘤[3]、老年癡呆癥[4]、動(dòng)脈粥樣硬化[5]等。抗氧化劑或自由基清除劑能有效抑制或緩解自由基和活性氧對(duì)機(jī)體的不利影響，起到防病、治病和延緩衰老的作用。近年來對(duì)中藥大量的研究表明：中國傳統(tǒng)中草藥是很有潛力的天然抗氧化劑來源，其療效與具有的抗氧化性能密切相關(guān)[6]。目前，國內(nèi)外不少學(xué)者對(duì)各種中藥提取物進(jìn)行了抗氧化性研究，但他們大多只是對(duì)某單味中藥的抗氧化性進(jìn)行研究[7-9]。

涼茶是嶺南人民根據(jù)本地的氣候、水土特性，在長期預(yù)防疾病與保健的過程中以中醫(yī)養(yǎng)生理論為指導(dǎo)，以多種中草藥為基礎(chǔ)，研制總結(jié)出的一類具有清熱解毒、生津止渴等功效的飲料總稱[10]。近來有研究指出廣東涼茶能緩解小鼠細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)從而達(dá)到“瀉火”的功效[11]。本研究將對(duì)20種市售涼茶類植物飲料的體外抗氧化性和相關(guān)功效成分進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步解釋涼茶“清熱解毒、下火去濕”的功效和開發(fā)新型涼茶保健產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售20種涼茶類植物飲料，依次編號(hào)為1#～20#，生產(chǎn)日期皆在2010年3～4月間，其中1#～13#購于廣州好當(dāng)家超市，14#～16#和17#～20#分別購自廣州兩家知名的傳統(tǒng)涼茶鋪，儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。

Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)、(+)-兒茶素、福林酚試劑(Folin-Ciocalteu reagent)、 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 美國Sigma公司；AAPH [2,2'-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride]、熒光素鈉鹽 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Wallace 1420 VICTOR3熒光免疫分析儀 新加坡Perkin Elmer公司；Alpha 1-2 LD真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；Eppendorf 5804R離心機(jī) 德國Eppendorf公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考Enayat等[12]的方法，略作修改。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，將涼茶樣品稀釋20倍，分別取1mL稀釋液，加入5mL 0.005g/100mL DPPH甲醇溶液，立即混勻，30min后用溶劑作參比在517nm波長測(cè)定其吸光度。以500μmol/L Trolox溶液作為陽性對(duì)照，清除DPPH自由基能力按式

(1)計(jì)算。

式中：A0為1mL 蒸餾水+ 5mL DPPH甲醇溶液的吸光度；A1為1mL 樣品稀釋液+ 5mL DPPH甲醇溶液的吸光度；A2為1mL 樣品稀釋液+ 5mL甲醇的吸光度。

1.3.2 氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)分析

參考Huang等[13]的方法并加以改進(jìn)。具體測(cè)定方法如下：將樣品、Trolox和熒光素鈉鹽溶解于75mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)。在96多微孔板中依次加入20μL稀釋到合適倍數(shù)的樣液或者不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液(6.25～50μmol/L)，空白對(duì)照孔加入磷酸鹽緩沖溶液。然后用排槍每孔加入200μL 熒光素鈉鹽溶液(95.6nmol/L)。96多微孔板的四周邊緣行加入磷酸鹽緩沖溶液作為保護(hù)行，將微孔板放入Wallace 1420 VICTOR3熒光免疫分析儀中，用Wallace 1420 Manager軟件設(shè)定程序，自動(dòng)混勻，37℃預(yù)熱20min。最后，用排槍迅速加入20μL AAPH(119.4 mmol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用)，自動(dòng)混勻，馬上開始測(cè)定。 熒光強(qiáng)度值(激發(fā)波長485nm；吸收波長535nm)每2.5min記錄一次，每次記錄前自動(dòng)振蕩混勻8s，共測(cè)定35 個(gè)循環(huán)。熒光強(qiáng)度分別記錄為f1, f2, f3,……f35。每次測(cè)試都做Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)公式統(tǒng)計(jì)各濃度樣品的AUC值[13]：

AUC = (0.5×f1/f1+ f2/f1+f3/f1+ … + fi/f1+… f34/f1+ 0.5× f35/f1)×2.5

最終結(jié)果根據(jù)空白與樣品所得熒光猝滅曲線下的面積差計(jì)算得出，表示為Trolox 當(dāng)量(trolox equivalents，TE)，單位是μmol TE/L。

1.3.3 Fe3+還原能力測(cè)定

參照Zhao等[14]的方法，略作修改。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，將涼茶原液稀釋20倍，分別取1mL稀釋液，加入2.5mL磷酸緩沖液 (200mmol/L，pH6.6) 以及 2.5mL 1g/100mL鐵氰化鉀溶液，混勻。 50℃恒溫水浴20min后加入 2.5mL 10g/100mL三氯乙酸溶液，3500r/min 離心10min。取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1g/100mL三氯化鐵溶液。靜置10min后，在700nm波長處檢測(cè)吸光度。吸光度越大，說明還原能力越強(qiáng)[8]?？紤]到某些涼茶樣品具有深淺不一的棕褐色，每個(gè)樣品都做對(duì)應(yīng)的空白背景值測(cè)定(即實(shí)驗(yàn)步驟中不加入鐵氰化鉀溶液，以蒸餾水替代)。以抗壞血酸(30～210μg/mL)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，還原能力用抗壞血酸當(dāng)量AAE (ascorbic acid equivalents，AAE)表示，單位為μg AAE/mL。

1.3.4 總酚含量的測(cè)定

總酚含量采用Folin-Ciocalteu法[15]測(cè)定。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，14～20號(hào)涼茶樣品稀釋10倍。取0.5mL涼茶樣液于15mL具塞比色管中，加入0.5mL Folin-Ciocalteau試劑、2mL 蒸餾水，混勻反應(yīng)6min后加入5.0mL Na2CO3溶液(70g/L)和4mL蒸餾水，室溫放置90min后于760nm波長處檢測(cè)吸光度，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(25、50、75、100、125、150、175、200μg/mL)。重復(fù)3次，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalents，GAE)表示，單位為μgGAE/mL?？紤]到某些涼茶樣品具有深淺不一的棕褐色，每個(gè)樣品都做對(duì)應(yīng)的空白背景值測(cè)定(即實(shí)驗(yàn)步驟中不加入Folin-Ciocalteau試劑，以蒸餾水替代)。

1.3.5 黃酮含量的測(cè)定

參考Enayat 等[12]的方法并加以改進(jìn)。具體測(cè)定方法如下：在96多微孔板中依次加入35μL涼茶樣液、140μL ddH2O、10.5μL 5g/100mLNaNO2溶液。放入Wallace 1420 VICTOR3熒光免疫分析儀中設(shè)定程序自動(dòng)混勻，25℃放置5min。加入10.5μL 10g/100mL AlCl3溶液。6 min后，加入70μL 1 mol/L NaOH溶液和84μL ddH2O。置于免疫分析儀中490nm波長處檢測(cè)吸光度。以(+)-兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(20、40、 60、 80、100、120、140、160μg/mL)。重復(fù)3次，結(jié)果以(+)-兒茶素當(dāng)量(catechin equivalents，CE)表示，單位為μg CE/ mL?？紤]到某些涼茶樣品具有深淺不一的棕褐色，每個(gè)樣品都做對(duì)應(yīng)的空白背景值測(cè)定(即實(shí)驗(yàn)步驟中不加入NaOH溶液，以蒸餾水替代)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SAS 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組實(shí)驗(yàn)中每個(gè)涼茶樣品平行測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。顯著性分析采用t檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 涼茶對(duì)DPPH自由基的清除率

由表1可知，20種涼茶對(duì)DPPH自由基均有不同程度的清除作用，其中20#(95.51±0.12)%、15#(92.08± 0.30 )%、19#(91.19±0.48)% 這3種涼茶對(duì)DPPH自由基的清除作用均超過90%，具有很強(qiáng)的抗氧化作用。另外，DPPH自由基清除率大于50%的涼茶樣品還包括18#、11#、17#、14#。本研究中所有涼茶的DPPH自由基清除率皆高于陽性對(duì)照：500 μmol/L Trolox 溶液，清除率為(4.91±0.23)%。

2.2 ORAC 測(cè)定結(jié)果

ORAC方法，又稱為抗氧化能力指數(shù)，目前作為國際抗氧化能力測(cè)定的新標(biāo)準(zhǔn)，是當(dāng)今抗氧化研究領(lǐng)域中人們最關(guān)注的評(píng)價(jià)方法之一。ORAC 值越高，抗氧化能力就越強(qiáng)[13]。

由表1可知，20種涼茶樣液的ORAC值變化很大，為2087.52～6315.24μmol TE/L?？寡趸芰χ笖?shù)最高的前5個(gè)涼茶樣品依次為17#＞15#＞14#＞18#＞20#。17#與15#間的差異不顯著(P＞ 0.05)，15#與其余3種涼茶的差異顯著(P＜0.05)，14#、18#與20#三者間的差異不顯著(P＞ 0.05)。

2.3 Fe3+還原能力

植物活性成分的還原能力可作為其潛在抗氧化能力的重要信號(hào)。具有還原能力的物質(zhì)能夠還原脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的中間體，從而表現(xiàn)其抗氧化作用[14]。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定Fe3+還原能力來進(jìn)一步衡量各種涼茶的抗氧化性。由表1可知，各個(gè)涼茶樣液都具有一定的Fe3+還原能力，為21.12～355.41μg AAE/ mL。還原能力最高的是20#(355.41μg AAE/ mL，即2.02 μmol AAE/mL)，該涼茶的還原能力高于胡蘿卜汁(1.89 μmol AAE/mL)[16]和綠茶(1.54μmol AAE/mL)[16]。其次是18#涼茶(203.57μg AAE/ mL，即1.16μmol AAE/mL)，其還原能力雖然低于綠茶但仍略高于紅葡萄汁(1.14μmol AAE/mL)[16]。

2.4 涼茶樣液的總酚含量及黃酮含量

圖1 1#～13#涼茶總酚含量Fig.1 Total phenol contents in herbal tea products 1#-13#

植物酚類化合物是近年天然抗氧化劑研究的熱點(diǎn)之一，其酚羥基結(jié)構(gòu)對(duì)活性氧等自由基具有很強(qiáng)的清除能力，是構(gòu)成中草藥抗氧化功效的重要功能性成分。由圖1可知，1#～13#涼茶液的總酚含量變化很大，為30.13～293.24μg GAE/mL。其中2#、11#、13#、3#、6#、9#等6種涼茶的總酚含量均高于100μg GAE/mL。14#～20#涼茶樣液是由涼茶原液經(jīng)10倍稀釋后得到的，稀釋后的涼茶總酚含量仍然很高，總酚含量大小順序依次為18#(232.58±2.99)μg GAE/ mL＞20#(224.58±2.04) μg GAE/mL＞19#(151.69±2.04)μg GAE/ mL＞15#(148.58± 3.14)μg GAE/ mL＞17#(86.36±1.10)μg GAE/ mL＞16#(76.58±1.41)μg GAE/ mL＞14#(67.24±4.56)μg GAE/ mL。

表1 20種涼茶所含的中草藥種類及抗氧化能力Table 1 Chinese herb varieties and antioxidant activities of twenty kinds of commercial herbal tea

圖2 20種涼茶黃酮含量Fig.2 Flavonoid contents in twenty kinds of commercial herbal tea

由圖2可知，與總酚含量的測(cè)定結(jié)果類似，20種涼茶的黃酮含量變化也很大。15#的黃酮含量最高，為(249.96±7.21)μg CE/mL，10#的黃酮含量最低，僅為(4.89±0.19)μg CE/ mL。

2.5 總抗氧化活性的綜合模糊評(píng)價(jià)

利用DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、ORAC法和Fe3+還原能力實(shí)驗(yàn)對(duì)20種市售涼茶類植物飲料的抗氧化性進(jìn)行比較研究，由于不同的測(cè)定方法有不同的反應(yīng)機(jī)理，同一涼茶樣液在不同的測(cè)定體系中測(cè)到的抗氧化性各不相同。為了對(duì)20種市售涼茶類植物飲料抗氧化性進(jìn)行系統(tǒng)的綜合評(píng)價(jià)，本研究運(yùn)用模糊評(píng)價(jià)理論建立多因素綜合評(píng)價(jià)數(shù)學(xué)模型[17]，以期對(duì)所測(cè)涼茶的抗氧化活性作綜合比較研究。

根據(jù)極值標(biāo)準(zhǔn)化公式Zij=(Xij-Xijmin)/(Xijmax-Xijmin)，將原始性狀指標(biāo)值無量綱化置于閉區(qū)間[0,1]上。其中，Xij為第i號(hào)涼茶，第j個(gè)抗氧化方法指標(biāo)值，Xijmax、Xijmin分別為第i號(hào)涼茶，第j個(gè)抗氧化方法指標(biāo)的最大值和最小值?？寡趸C合評(píng)價(jià)值Zi=∑Zij(i=1,2,…,20；j=1,2,3)，計(jì)算結(jié)果見表1。

抗氧化綜合評(píng)價(jià)值最高的前10種涼茶樣品依次為20#＞15#＞18#＞17#= 19#＞11#＞14#＞2#＞16#＞6#。其中的7種涼茶(14#～20#)皆是購自本地傳統(tǒng)涼茶鋪的涼茶(保質(zhì)期3d)。由此推測(cè)，傳統(tǒng)涼茶鋪的涼茶比超市貨架的涼茶類植物飲料具有更高的抗氧化性，這可能是因?yàn)閮深悰霾璧闹谱鞴に嚭椭胁菟幱昧坑兴煌?。傳統(tǒng)涼茶鋪更為注重涼茶“清熱解毒、下火去濕”的藥用功效，中草藥用量多，口味偏苦澀，而超市貨架的涼茶類植物飲料則可能更強(qiáng)調(diào)良好的口味，因此中草藥的添加量相對(duì)較少。超市貨架的涼茶類植物飲料(保質(zhì)期12個(gè)月)在長期放置的過程中抗氧化活性成分也可能有所損失。

2.6 20種涼茶的抗氧化綜合評(píng)價(jià)值與總酚、黃酮含量的相關(guān)性

比較20種涼茶的總酚含量與其抗氧化綜合評(píng)價(jià)值(Zi值)之間的相關(guān)性關(guān)系，結(jié)果如圖3、4所示。

圖3 1#～13#涼茶總酚含量與抗氧化綜合評(píng)價(jià)值的相關(guān)性Fig.3 Correlation between total phenol content and antioxidant evaluation value of herbal tea products 1#-13#

圖4 14#～20#涼茶稀釋液總酚含量與抗氧化綜合評(píng)價(jià)值的相關(guān)性Fig.4 Correlation between total phenol content and antioxidant evaluation values of herbal tea products 14#-20#

圖5 20種涼茶黃酮含量與抗氧化綜合評(píng)價(jià)值的相關(guān)性Fig.5 Correlation between flavonoid content and antioxidant evaluation values of twenty kinds of commercial herbal tea

1#～13#涼茶的總酚含量與抗氧化綜合評(píng)價(jià)值之間的線性關(guān)系方程式為y = 0.0042x + 0.0188，相關(guān)系數(shù)是0.6627(圖3)，14#～20#涼茶稀釋液的總酚含量與抗氧化綜合評(píng)價(jià)值之間的線性關(guān)系方程式為y = 0.0071x + 0.8853，相關(guān)系數(shù)是0.6051(圖4)，表明20種涼茶的抗氧化性都與總酚含量有一定的相關(guān)性，但線形關(guān)系不顯著。同時(shí)，分析20種涼茶抗氧化綜合評(píng)價(jià)值與黃酮含量的關(guān)系，結(jié)果表明二者的相關(guān)性較低(y = 0.009x + 0.4820，R2=0.3922)(圖5)，進(jìn)一步表明本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的20種涼茶的抗氧化性主要成分不僅是多酚類物質(zhì)，還存在其他具有抗氧化作用的物質(zhì)(如多糖、類萜等)。

另一方面，采用Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定的總酚含量是一個(gè)相對(duì)值，不同的酚類具有不同的結(jié)構(gòu)和量效關(guān)系，從而具有不同的抗氧化作用[18]。再者，大部分涼茶配方是根據(jù)中醫(yī)理論由多種中草藥復(fù)合配伍而成，并非單味中草藥，而不同的中草藥具有不同的化學(xué)成分以及它們之間可能存在的相互協(xié)同作用，故不同的涼茶配方具有不同的抗氧化作用。從表1也可以發(fā)現(xiàn)，即使是選用相同中草藥煎制的涼茶，也可能由于煎制工藝和中藥添加量的差異而表現(xiàn)出不同的抗氧化效果。

3 結(jié) 論

利用DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、ORAC法和Fe3+還原能力實(shí)驗(yàn)考察了20種市售涼茶類植物飲料的抗氧化性，結(jié)果表明20種涼茶均表現(xiàn)出了不同程度的抗氧化能力。運(yùn)用模糊評(píng)價(jià)理論建立的抗氧化綜合評(píng)價(jià)模型表明，5種傳統(tǒng)涼茶鋪出售的涼茶比超市出售的涼茶類植物飲料具有更高的抗氧化活性，這可能是因?yàn)閮深悰霾璧闹谱鞴に嚭椭胁菟幱昧坑兴煌?/p>

另外，比較各涼茶試樣的總酚含量與其抗氧化能力之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，1#～13#涼茶的總酚含量與抗氧化綜合評(píng)價(jià)值之間的相關(guān)系數(shù)是0.6627，14#～20#涼茶稀釋液的總酚含量與抗氧化綜合評(píng)價(jià)值之間的相關(guān)系數(shù)是0.6051，相關(guān)性不明顯，這一方面可能是與多酚種類以及含有其他抗氧化活性類物質(zhì)有關(guān)，另一方面是由于不同涼茶配方使用不同的中草藥種類、用量以及中草藥之間可能存在相互協(xié)同作用。

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Comparison of Antioxidant Activities of Twenty Kinds of Commercial Herbal Tea

HE Qiu-tong，YU Yi-gang*，LI Cong-cong，LI Jing-tong，WU Hui
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Twenty kinds of herbal tea purchased from the local market were assessed for their antioxidant activities including DPPH radical scavenging activity, oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and Fe3+reducing power. Results indicated that all 20 kinds of herbal tea had antioxidant capacities in different antioxidant evaluation systems. In addition, a fuzzy comprehensive evaluation model was established to evaluate their comprehensive antioxidant capacity and five kinds of herbal tea with the highest comprehensive antioxidant capacity were all from two locally famous traditional herbal tea shops. A non-linear correlation between total phenol content and comprehensive antioxidant capacity of twenty kinds of herbal tea was achieved.

antioxidant activity；herbal tea；total phenol content；flavonoid content；fuzzy comprehensive evaluation

TS275.2

A

1002-6630(2011)07-0047-05

2010-06-11

2009年度廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(9151064101000070)；2010年廣東省大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(S1010561066)

何秋彤(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：Heqiutong430@163.com

*通信作者：余以剛(1968—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：yuyigang@scut.edu.cn