任懂平 肖建華

細菌、病毒等微生物入侵機體啟動了機體免疫防御機制，原有和募集的各種免疫細胞在其產(chǎn)生的細胞因子和趨化因子等的相互作用下，發(fā)生了“正”與“邪”的斗爭。為了探知這一斗爭的詳細機制及治療方法，人們建立了各種感染模型，如細菌注入感染模型、內(nèi)毒素模型、外傷感染模型和腹膜炎感染模型等。其中，內(nèi)毒素模型便于排除其他干擾因素，有利于研究感染細菌單一成分在感染發(fā)生發(fā)展中的詳細機制,為感染性休克治療和預(yù)防提供了較好的模型[1]。本文就小鼠脂多糖感染模型的特點影響因素、分子機制、細胞學(xué)變化及其與人類相關(guān)疾病的差異綜述如下。

1 脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）模型的特點、復(fù)制方法及影響因素

脂多糖模型是指應(yīng)用細菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)動物產(chǎn)生與人類膿毒癥相似的病理反應(yīng)，是常用的膿毒癥動物模型復(fù)制方法。LPS是革蘭氏陰性菌主要細胞表面抗原和激發(fā)宿主對細菌感染發(fā)生反應(yīng)的主要生物效應(yīng)器。LPS屬病原體相關(guān)分子模式（PAMP），免疫刺激作用強[2]。它可以激活單核-巨噬細胞系統(tǒng)（mononuclear phagacy tic system，MPS），引起TNF-α、IL-12、IFN-γ等[3]大量炎癥介質(zhì)釋放，導(dǎo)致全身過度炎癥反應(yīng)及腦、心、肺、腎、肝等器官的衰竭和壞死。LPS模型的免疫病理特征是固有免疫反應(yīng)過度激活，伴隨大量的炎性細胞因子，如TNF、IL-6、IL-1，其中最關(guān)鍵的是TNF[2]。常用的處理方式有：少量單次注射、少量多次注射、大量單次注射、呼吸道吸入或滴入、靜脈注射等。靜脈注射LPS也會出現(xiàn)腹腔注射時的膿毒癥癥狀，如血液動力學(xué)改變等[4]。

LPS純度等因素對感染模型有不同影響。Anas等應(yīng)用缺乏核心多糖的rough LPS（R-LPS）和含有核心多糖的smooth LPS（S-LPS）通過CD14誘導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)強度具有LPS劑量依賴性。低劑量時S-LPS和R-LPS以CD14依賴的方式誘導(dǎo)中性粒細胞浸潤。此外，低劑量S-LPS也以CD14依賴的方式誘導(dǎo)炎癥細胞因子的釋放。而高劑量S-LPS和R-LPS在存在大量可溶性CD14（soluble CD14，sCD14）時中性粒細胞浸潤和釋放TNF的能力降低了[5]。此外，不同性別小鼠對LPS的反應(yīng)也不同，雌性小鼠較雄性小鼠更能耐受LPS打擊[6]，究其原因可能與雌激素的分泌有關(guān)。

2 LPS結(jié)合蛋白-CD14-TLRs信號傳導(dǎo)通路（LBP-CD14-TLRs Signal Transduction Path Way）

2.1 脂多糖結(jié)合蛋白（LPS-bind ing p rotein，LBP）與CD14介導(dǎo)細胞激活的信號傳導(dǎo)

LBP能提高類脂A刺激腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α的靈敏度和反應(yīng)性，也能增強LPS誘導(dǎo)其它細胞因子和NO的產(chǎn)生，它有兩個功能域，一個與LPS結(jié)合，另一個介導(dǎo)LPS與CD14的相互作用[7]。LPS-LBP復(fù)合物進一步與CD14結(jié)合才能刺激細胞，使信號向胞內(nèi)傳遞而表現(xiàn)出生物學(xué)效應(yīng)。普遍認為CD14存在兩種形式：以糖基磷脂酰肌醇尾巴（glycophosphatidy linositol，GPI）錨定在單核巨噬細胞表面的膜CD14（membrane CD14，mCD14）和缺乏GPI的可溶性（soluble CD14，sCD14）。sCD14有多條生成途徑，在磷脂酰肌醇特異的磷脂酶C作用下，CD14陽性細胞能釋放sCD14；m CD14也能通過蛋白酶從膜上降解；磷脂酶D也能催化CD14的釋放，但其詳細機制還不清楚；此外，CD14還可以由髓系細胞直接分泌[8]。對sCD14的研究較少，一般認為它在LPS刺激內(nèi)皮細胞、上皮細胞等本身無m CD 14的細胞中起了一定作用。此外，Haziot等[9]研究表明，高濃度的sCD14可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞分泌TNF，從而妨礙了LPS轉(zhuǎn)變?yōu)橹鞍走M而清除這一過程，表明sCD14對LPS的毒性的作用也具有兩面性。

2.2 Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）

TLRs是固有免疫系統(tǒng)中具有重要作用的跨膜受體家族。TLRs可以識別許多微生物配體。有證據(jù)表明TLRs能夠敏感地察知壓力、外傷和組織缺血釋放的各種內(nèi)源性因子[10]。TLR家族成員很多，主要在單核巨噬細胞表面表達。現(xiàn)已明確，LPS可以與各種細胞表面的TLR 4結(jié)合。進入血液循環(huán)的少量LPS首先與血清中LBP結(jié)合，由LBP轉(zhuǎn)運給巨噬細胞表面高親和力LPS受體（即m CD14），LBP隨之被釋放，由于CD14缺乏跨膜和胞漿區(qū)，不能單獨傳導(dǎo)LPS信號，但CD14可促進LPS與TLR 4結(jié)合。另外，髓樣分化蛋白2（MD-2）也是TLR4識別LPS所必需的輔助分子，MD-2與TLR4結(jié)合可顯著增強LPS的敏感性。TLR4識別LPS后啟動活化信號，使巨噬細胞激活并參與炎癥反應(yīng)。一旦TLR 4被激活，即可激活受體相關(guān)激酶和NF-κB，后者轉(zhuǎn)位入核內(nèi)誘導(dǎo)促炎癥性細胞因子產(chǎn)生。缺失m CD14或TLR4的小鼠不能對LPS刺激產(chǎn)生強烈的應(yīng)答[11]。

各種TLRs并非單獨發(fā)揮作用的，各種受體之間相互作用或協(xié)同作用發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)。在對抗革蘭氏陰性菌的固有免疫反應(yīng)中TLR4和TLR 9互相合作，互相補充發(fā)揮著宿主的抗菌作用。Bhan等[12]利用TLR4缺陷小鼠、TLR9缺陷及雙重缺陷小鼠證實TLR 4和TLR9任一缺陷都可以導(dǎo)致肺部感染G-菌清除率下降炎癥因子分泌異常，并且證明TNF-α、IL-12及趨化因子依賴于TLR 4，而IFN-γ分泌依賴于TLR 9；IL-13、IL-17等因子必需TLR4和TLR 9兩者共同參與才能產(chǎn)生。此外，缺乏M yD88的小鼠較缺乏單個TLR（如TLR2、TLR4）對抗胞內(nèi)、外感染的能力要弱的多，從而表明TLRs之間存在著協(xié)同作用，甚至可以代償某個TLR的缺失[13]。

3 脂多糖感染模型的細胞學(xué)變化

免疫機能障礙及相關(guān)免疫抑制是感染后敗血癥綜合征的標(biāo)志之一。LPS感染模型中免疫細胞的數(shù)目等變化與不同的模型聯(lián)系甚為緊密。有人發(fā)現(xiàn)感染性休克和膿毒癥會出現(xiàn)T細胞和DCs的廣泛死亡[14]，因此，感染病人和小鼠體內(nèi)DCs缺失可能是免疫抑制的原因之一。Gautier等[11]發(fā)現(xiàn)促進LPS感染小鼠體內(nèi)DCs存活可以降低亞致死量LPS誘導(dǎo)的免疫抑制，維持Th1細胞的分化及增強T細胞的活化和增殖。因此DCs誘導(dǎo)性凋亡可能是內(nèi)毒素致小鼠免疫抑制和高病死率的一個決定因素，而減少DCs死亡或許是一種對抗感染性休克的有效方法。龔非力等[15]應(yīng)用Jak2缺陷小鼠研究Jak2和DCs的關(guān)系，結(jié)果表明，Jak2缺陷小鼠可以顯著地抵抗致死劑量LPS誘導(dǎo)的感染性休克，而過繼正常小鼠的DCs可以恢復(fù)小鼠對LPS的敏感性；表明Jak2/STAT5是DCs發(fā)育和成熟的核心通路，但是DCs分泌促炎癥因子的能力受Jak2/STAT5和Jak2/STAT6兩條信號通路調(diào)節(jié)。

LPS處理小鼠可以導(dǎo)致幼稚的單核系細胞和粒系細胞即髓源抑制細胞（MDSCs）的增多。De W ilde等[16]應(yīng)用亞致死量LPS處理小鼠兩次后，可以誘導(dǎo)小鼠對LPS脫敏，繼而用致死量LPS處理不會導(dǎo)致小鼠死亡。并且LPS處理后骨髓、脾臟和淋巴結(jié)CD11b+Gr1+細胞增加至四倍，骨髓CD11b+Gr1+細胞在第3d達到峰值，脾臟CD11b+Gr1+細胞在第7d達到峰值，這群細胞可以持續(xù)存在15d。此外，處理小鼠分泌TNF-、IL-12、IFN-r和IL-6顯著下降，而IL-10分泌僅有輕微下調(diào)。最近有報道稱LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的MDSCs可以使小鼠的移植皮膚耐受，延長移植皮膚的存活時間，其機制是通過分泌IL-10、血紅素氧化酶-1（HO-1）發(fā)揮T細胞的免疫抑制作用[17]。此外，Greifenbery等[18]研究表明聯(lián)合IFN-和LPS可以促進MDSCs發(fā)育和激活同時阻斷髓系細胞向DCs分化。據(jù)此他們提出一種慢性感染和sepsis模型，即先使用LPS激發(fā)宿主固有免疫反應(yīng)，隨后模擬適應(yīng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)生大量的T細胞分泌大量IFN-。他們證實LPS結(jié)合IFN-是刺激MDSCs累積和封閉DCs的絕好范例之一。

4 LPS感染模型與人類感染疾病的差異

有研究證實抑制脂多糖感染模型的促炎性因子具有明顯的治療效果；然而，該方法臨床效果卻不明顯[18]，其原因可能是脂多糖模型與臨床感染疾病之間存在很大的差異。例如，大量注射LPS導(dǎo)致全身炎性細胞因子水平急速上升，而人類感染和sepsis細胞因子水平升高并不十分明顯，并且相對延后[19]。此外，對比人類和小鼠對LPS的反應(yīng)，證實小鼠對LPS有相對的耐受性，表明不同物種的內(nèi)毒素敏感性有一定的差異，這種差異影響了動物模型的臨床相關(guān)性[20]。另外，注射LPS的劑量和誘導(dǎo)DCs的凋亡相關(guān)，給小鼠注射LPS 48h后DCs減少，4～5dDCs出現(xiàn)大量缺失；而人類感染病人1～2d DCs出現(xiàn)大量缺失[11]，較小鼠敏感。

5 結(jié)語

多年來，對細菌體內(nèi)各部分功能的了解和對宿主——細菌相互作用機制的深入研究，也促進了臨床對細菌感染疾病的治療和預(yù)防。然而，由于不同致病菌具有不同的結(jié)構(gòu)，免疫系統(tǒng)需要同時做出一般性反應(yīng)和特異性反應(yīng)。大量實驗揭示了諸如TLRs、IL-1、IL-6等關(guān)鍵分子，在哺乳動物宿主識別和清除病原體的“戰(zhàn)役”中發(fā)揮重要的作用。不同感染模型的受體和細胞因子通路也不完全相同，因此不能將動物實驗中有效的治療方法簡單地應(yīng)用于人類臨床治療[18]，需要結(jié)合人類相關(guān)疾病的特點多層次分階段的治療。此外，也需要不斷地改進LPS感染模型如聯(lián)合使用某些試劑（如IFN-r[18]等）復(fù)制動物模型，使之具有更多的臨床相關(guān)性。

[1]Serlhan CN,Savill J.Resolution of inflammation：the begining programs the end[J].Nat Immunol,2005,6（12）：1191-1197.

[2]Jerala R. Structural biology of the LPS recognition[J].Int J Med Microbiol,2007,297（5）：353-363.

[3]Heine H, Rietschel ET,Ulmer AJ,et al.The biology of endotoxin[J].Mol Biotechnol,2001,19（3）：279-296.

[4]Knapp S,Florquin S,Golenbock DT,et al.Pulmonary lipopolysaccharide（LPS）-binding protein inhibits the LPS-induced lung inflammation in vivo[J]. J Immunol,2006,176（5）：3189-3195.

[5]Anas AA,Hovius JWR,van’t Veer C,et al.Role of CD14 in a Mouse Model of Acute Lung inflammation Induced by Different Lipopolysaccharide Chemotypes[J].PLoS ONE,2010,5（4）：e10183（1-8）.

[6]Jon A,BHolzmann B,Sitkovsky M,et al.Animal models of sepsis：setting the stage[J].Nat Rev Drugdiscov,2005,4（10）：854-865.

[7]Tsukamoto H,Fukudome K,Takao S,et al.Lipopolysaccharidebinding protein-mediated Toll-like receptor 4 dimerization enables rapid signal transduction against lipopolysaccharide stimulation on membrane-associated CD14-expressing cells[J].Int Immunol,2010,22（4）：271-280.

[8]Kitchens RL,Thompson PA,et al.Modulatory effects of sCD14 and LBP on LPS-host cell interactions[J].J Endotoxin Res,2005,11（4）：225-229.

[9]Haziot A,Rong GW,Bazil V,et al.Recombinant soluble CD14 inhibits LPS-induced tumor necrosis factor-alpha production by cells in whole blood[J].J Immunol,1994,152：5868-5876.

[10]Kaczorow sk i DJ,Af raz i A,Scot t MJ,et a l.Pivota l advance：The pattern recognition receptor ligands lipoposaccharide and polyinosine-polycytidylic acid stimulate factor B synthesis[J].J Leukoc Biol,2010,88（4）：609-618.

[11]Gautier EL,Huby T,Saint-Charles F,et al.Enhanced Dendritic cell survival altenuate lipopolysaccharide-induced immunosuppression and increases resistance to lethal Endotoxic shock[J].J Immunol, 2008,180（10）：6941-6946.

[12]Bhan U,Ballinger MN,Zeng X,et al.Cooperative Interactions between TLR4 and TLR9 Regulate Interleukin 23 and 17 Production in a Murine Model of Gram Negative Bacterial Pneumonia[J].PLoS ONE,2010,5（3）：e9896（1-11）.

[13]Skerrett SJ,Wilson CB,Liggitt HD,et al.Redundant Toll-like receptor signaling in the pulmonary host response to Pseudomonas aeruginosa[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2007,292：L312-322.

[14]Hotchkiss RS,Nicholson DW.Apoptosis and caspases regulate death and IFN lammation in sepsis[J].Nat Rev Immunol,2006,6：813-822.

[15]Zhong J,Yang P,Muta K,et al.Loss of Jak2 Selectively Suppresses DC-Mediated Innate Immune Response and Protects Mice from Lethal Dose of LPS-Induced Septic Shock[J].PLoS ONE,2010,5（3）：e9593（1-10）.

[16]De Wilde V,Van Rompaey N,Hill M,et al.Endotoxin-induced myeloid-derived suppressor cells inhibit alloimmune response via heme oxygenase-1[J].Transplantation,2009,9：2034-2047.

[17]Dugast AS,Haudebourg T,Coulon F,et al.Myeloid-derived suppressor cells accumulate in kidney allograft tolerance and specifically suppress effector T cell expansion[J].Immunol,2008,180：7898-7906.

[18]Greifenberg V,Ribechini E,R ssner S,et al.myeloid-derived suppressor cell activation by combined LPS and IFN-treatment impairs DC development[J].Eur J Immunol,2009,39（10）：2865-2876.

[19]Rittirsch D,Hoesel LM,Ward PA.The disconnect between animal models of sepsis and human sepsis[J].Leukoc.Biol,2007,81：137-143.

[20]Copeland S,Warren HS,Lowry SF,et al.Acute inflammatory response to endotoxin in mice and humans[J].Clin Diagn Lab Immunol,2005,12：60-67.