李逸龍

（山東農業(yè)大學，泰安，271018）

種子是農業(yè)生產中最基本和最關鍵的生產資料，其純度的高低是衡量種子質量優(yōu)劣的主要指標，我國對不同作物種子的純度進行了嚴格的規(guī)定。種子純度降低會顯著降低作物的產量和產品品質。當前我國農作物種子純度低劣狀況普遍存在，以玉米為例，1994年抽檢了88個樣品，合格率為0，種子純度在90%以上的僅占14.8%，純度最低的只有59.5%；1995年抽檢了63個樣品，合格樣品1份，占1.6%，純度在90%以上的占23.8%，純度最低的為73.2%。而研究表明，種子純度為96.5%和95.6%的玉米比純度為98.6%的分別減產10.5%和11.1%[1]。因此，提高種子純度是保證農作物優(yōu)質高產的基礎，對農作物的大田生產和質量監(jiān)督起決定作用。在我國，種子純度低的原因主要有2個，一是由種子生產、收獲、脫粒、加工、運輸?shù)冗^程中的生物混雜和機械混雜造成的；二是一些繁種單位或個人為了片面追求經濟效益而忽視種子質量，甚至摻雜使假，導致種子純度降低。種子純度降低會使農民蒙受巨大的經濟損失[2]，所以我國不斷地對種子的純度進行調整和嚴格規(guī)定，加大對種子企業(yè)的監(jiān)管和懲罰力度，以保證廣大農民的利益，促進農業(yè)市場的健康發(fā)展，增強企業(yè)競爭力。

1 農作物種子純度檢驗的含義及意義

種子純度的檢驗應包括兩方面內容，即種子的真實性和品種純度。種子的真實性是指供檢品種與文件記錄是否相符。品種純度是指品種典型特性一致的程度。品種純度檢驗的對象可以是種子、幼苗或比較成熟的植株。我國的《農作物種子檢驗規(guī)程》中明確指出，當送驗者對報檢的種或品種已有說明，并且具有一個可供比較的、可靠的標準樣品時，品種純度的鑒定才是有效的。

種子的真實性和品種純度是保證良種優(yōu)良遺傳特性得以充分發(fā)揮的前提，是正確評定種子等級的重要指標。種子純度在農業(yè)生產和種子生產中具有重要的應用價值，在品種登記管理、品種產權保護、品種親緣關系研究以及遺產多樣性研究中都有很高的應用價值[4]。

2 農作物種子純度檢驗的理論依據(jù)

伴隨著現(xiàn)代農業(yè)技術的不斷發(fā)展，種子純度鑒定技術由傳統(tǒng)的形態(tài)標記鑒定逐步發(fā)展到集形態(tài)標記鑒定、生化標記鑒定和DNA分子標記鑒定為一體的綜合鑒定技術體系。根據(jù)種子純度檢驗的發(fā)展歷史和植物性狀的表現(xiàn)差異，將農作物種子純度的檢驗分為2個階段。第1個階段為形態(tài)性狀方面的差異（也可稱為形態(tài)標記），如種子的形狀、種皮色澤，幼苗芽鞘色澤，成株期株形、株高、開展度，葉片形狀、葉色、花色、果形、果色、產量等，這些標記性狀是基因在形態(tài)方面的表達，可以直接通過觀察鑒定。第2個階段分為2個部分，一是生物化學成分方面的差異（也可稱為生化標記），如蛋白質、同工酶的差異，這些生化差異是不同基因表達的產物，通常不能直接通過觀察鑒定，必須采用一定的技術加以分析鑒定；二是調控品種性狀本身的遺傳物質的差異 （稱為DNA分子標記），DNA分子標記鑒定方法同樣需要一定的實驗技術和儀器，因其準確度高被廣泛認可。現(xiàn)在對種子純度的鑒定往往是采用形態(tài)鑒定與生化或分子鑒定相結合的方法。

根據(jù)種子純度檢驗法所依據(jù)的原理、檢驗對象的不同，還有其他多種檢驗方法。雖然鑒定品種純度的方法很多，但在實際生產中能廣泛應用的方法較少。我們現(xiàn)在主要的鑒定手段和方法多以我國標準和國際標準為依據(jù)，具有廣泛的實用性和適用性。

3 農作物種子純度檢驗技術研究進展

3.1 以形態(tài)標記為依據(jù)的檢驗技術

根據(jù)某一品種的種子、幼苗、成株具有區(qū)別于其他品種的形態(tài)特征來檢驗該品種種子的純度。該方法應用最早、最廣泛，并且目前仍是農作物種子純度檢驗的主要方法，主要包括種子形態(tài)鑒定法、幼苗形態(tài)鑒定法和田間小區(qū)種植鑒定法。

①種子形態(tài)鑒定法 是指檢驗人員用放大鏡或是解剖鏡等一些專用的檢測工具，根據(jù)不同作物品種種子特定的外觀形態(tài)特征進行鑒定。如鑒定玉米種子，其粒形有圓粒、扁粒、長粒之分；類型有馬齒型、半馬齒型、硬粒型之分；色澤有白、淺黃、橙黃、淺紅、紫色之分等。種子形態(tài)鑒定法適宜種子形態(tài)特征變化類型豐富的作物如玉米、水稻、豆類等，該法簡單、方便、直觀、成本低。其缺點是：a.難以區(qū)分種子形態(tài)特征差異較小的作物品種，如十字花科的大部分蔬菜、茄果類蔬菜等；b.種子的有些形態(tài)特征易受到環(huán)境條件的影響，如種子大小、色澤與種子的成熟度有關，因而會影響鑒定結果的準確性；c.鑒定結果受鑒定人員的主觀影響，鑒定者不同或水平不同均會影響結果的準確性。所以此方法檢驗的結果可靠性不夠高、適用范圍較狹窄[4]。同時，目前新品種多由數(shù)量有限的優(yōu)良親本經雜交育成，其遺傳變異性狀日趨狹窄，導致品種之間的形態(tài)學差異越來越小，且形態(tài)學鑒定方法通常需要2～3個生長周期，使得從形態(tài)上鑒定種子的純度差異變得越來越困難[5]。

②幼苗形態(tài)鑒定法 按要求取一定數(shù)量的種子，在溫室或人工氣候箱中培養(yǎng)成幼苗，當幼苗達到適宜評價的發(fā)育階段時，根據(jù)幼苗具有的形態(tài)特征進行純度檢驗。如根據(jù)水稻、小麥、玉米葉鞘的顏色（紅、綠、紫），番茄、茄子胚軸的顏色，葉片顏色，葉片形狀等特征區(qū)別品種。對于具有上述特征差異明顯的作物品種鑒定的準確性較高，檢驗所需的設備簡單、易于操作、成本較低。但對于遺傳差異不大、形態(tài)特征相似的品種鑒定的準確性較差，并且不同品種對處理時期和處理程度較為敏感，其他缺點同種子形態(tài)鑒定法。

③田間小區(qū)種植鑒定法 將樣品在田間播種，對作物進行統(tǒng)一的栽培和管理，然后根據(jù)植株不同時期的表現(xiàn)特征進行鑒定，尤其是作物生長關鍵時期的性狀，如玉米的抽穗期、花期與成熟期，各種性狀已充分顯現(xiàn)，因此鑒定結果相對比較準確、可靠。但是，一方面，受時間長、用地較多、成本高等因素的限制，該鑒定方法難以鑒定當年生產的種子的純度，不利于種子的收購定級和調運；另一方面，受環(huán)境條件和栽培手段的影響，如遇上外界自然災害，可能對鑒定結果產生不利影響。

3.2 以生化標記為依據(jù)的檢驗技術

主要是利用電泳技術對不同品種因基因水平的差異而引起的功能蛋白質種類、結構、數(shù)量的變化進行比較。生化標記鑒定法可分為同工酶電泳法和蛋白質電泳法。這種利用生化指標檢測種子純度的方法具有快捷、成本低、易于普及的特點，結果也比較客觀，不易受鑒定者主觀因素的影響。張承毅等[6]利用蛋白質電泳法對大白菜種子樣品進行分析，找到了晉菜3號、魯白1號2個雜交組合的雜交互補帶，并成功應用于大白菜種子純度的檢驗。

我國已建立了一套比較完整的蛋白質電泳技術體系，并成功應用于水稻、玉米、大麥、小麥、棉花、煙草、豌豆、蒜、蔥等農作物的品種鑒定中。其中，大麥和小麥品種的醇溶蛋白電泳、豌豆屬和黑麥草屬的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）以及玉米屬的醇溶蛋白超薄等電聚集（IEF）技術已列于國家種子規(guī)程之中。小麥醇溶蛋白電泳技術和玉米鹽溶蛋白質電泳鑒定方法，已分別列于《中華人民共和國農作物種子檢驗規(guī)章制度》和《中華人民共和國農業(yè)部行業(yè)標準》。

盡管同工酶和蛋白質電泳法越來越多地在農作物種子純度研究領域中得到應用，其優(yōu)點已得到多方的贊同，但是其也有不足之處。例如某些遺傳組成非常接近的品種，不易找到其父母本的特異蛋白，采用蛋白質電泳發(fā)難以發(fā)現(xiàn)特征帶；若制種所用親本不純、含有多個姊妹系或自交系在繁殖過程中發(fā)生變異，其蛋白質譜帶帶型不同，導致無法對其雜交種電泳時表現(xiàn)出的多種帶型進行判定。此外蛋白質變異位點有限，蛋白質多態(tài)性有較嚴格的組織與時間表達特異性，要求其蛋白產物易提取且易通過電泳來檢測。同時蛋白質或同功酶極不穩(wěn)定，受環(huán)境影響較大。正是上述問題導致了蛋白質與同功酶技術應用的局限性。

3.3 以DNA分子標記為依據(jù)的檢驗技術

在生物基因組中，DNA因存在倒位、易位、插入、缺失、轉座或排列不一的重復序列的現(xiàn)象，而表現(xiàn)出多態(tài)性。DNA分子標記是指生物基因組DNA經限制性內切酶酶切、聚合酶鏈式反應擴增或兩者結合等措施處理后電泳，以電泳譜帶的形式表現(xiàn)DNA的多態(tài)性，這種多態(tài)性在本質上反映了生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段。以DNA標記為依據(jù)的檢驗技術鑒定種子純度就是以DNA分子的多態(tài)性即DNA堿基排列順序的差異性為基礎。自從20世紀70年代最早提出RFLP方法以來，在10多a間出現(xiàn)了許多DNA標記檢測技術，概括起來可分為兩類：一類是以Southern轉移和分子雜交為基礎的技術，如RFLP；另一類是以PCR為基礎的技術，如RAPD、AFLP、SSR等。下面就幾種主要技術作一介紹。

①RFLP技術 是最早也是經典的DNA分子標記鑒定技術。它是根據(jù)不同基因組的限制性內切酶位點堿基突變、酶切位點之間發(fā)生了堿基的插入或缺失而導致酶切片段的大小發(fā)生變化，通過特定的探針與酶切片段雜交，檢測不同位點的等位變異，從而比較不同品種在DNA水平上的差異，以此來鑒別真假種子。其技術流程主要包括基因組DNA的提取、DNA的酶切、電泳分離、Southern轉移、探針標記（同位素或非同位素標記）、DNA分子雜交、多態(tài)性片段的檢測等。Matsuura等[7]利用RFLP克隆區(qū)分黃瓜親本NBl、GFl及其F1代雜交種，發(fā)現(xiàn)利用RFLP分析可快速檢測黃瓜雜交一代種子的純度。

RFLP標記技術優(yōu)點：a.無表型效應；b.呈典型的孟德爾式遺傳；c.在非等位的RFLP標記之間不存在上位效應，互不干擾。缺點：a.DNA用量大；b.操作煩瑣，技術復雜，工作量大；c.有放射性為害。RFLP標記技術在國內研究較少，近年來缺乏相關報道。

②RAPD技術 1990年由Williams在PCR的基礎上發(fā)明的一種最簡單的DNA分子標記技術。技術核心是用人工合成的隨機引物（10 bp）對基因組DNA進行PCR擴增，產生多態(tài)性DNA片段，經電泳分離和EB染色，獲取DNA多態(tài)信息。其技術流程包括基因組DNA的提取、PCR擴增、標記的檢測等。由于該技術成本相對比較低廉、操作簡單、可選擇的引物多、檢測到的多態(tài)性位點較多、不受環(huán)境條件的影響，克服了形態(tài)學鑒定和生化標記檢驗法的不足，因此該技術一出現(xiàn)便被廣泛應用于種子純度的檢驗。黃三文等[8]篩選出12個較穩(wěn)定的RAPD標記，可以用于中椒系列辣椒的9個雜交種的純度鑒定；宋順華等[9]應用RAPD標記鑒定大白菜雜種商品種子的純度，用50個隨機引物檢測了2個雜交種及其親本，其中有3個引物能清楚地區(qū)分雜交種及其雙親；莫結勝等[10]用RAPD標記檢測雜交油葵A15種子純度，引物OPD09、OPD12、OPK12不僅能鑒定出雜種及混雜的親本種子，還能將與A15外型相近的大部分雜交種區(qū)別開來。

RAPD標記技術優(yōu)點：a.可以對任何沒有分子生物學基礎信息的物種進行DNA多態(tài)性分析；b.與RFLP的作用類似，但其檢測效率更高、樣品用量更少、靈敏度更高等；c.以PCR為基礎，但又比PCR方便。但RAPD技術也有其不足之處，一是對其穩(wěn)定性一直有很多的爭論，特別是不同實驗室之間的重演性較差；二是RAPD標記為顯性標記，雜交種與親本之一的帶型有可能完全相同，如用單一引物便不能從這一位點區(qū)分是雜交種還是親本，因此必須選用能反映2個位點差異的引物進行擴增；三是對模板DNA的純度要求高。從總體上講，RAPD技術適合我國大多數(shù)檢測單位，是比較理想的種子純度鑒定方法，在我國農作物種子純度檢驗中發(fā)揮著重要作用。

③AFLP技術 1995年由Zabeau發(fā)明的一種檢測DNA分子標記能力極強的技術。其原理是對基因組DNA酶切片段進行選擇性擴增，經電泳分離和銀染，獲取DNA的多態(tài)信息。其主要操作流程為基因組DNA的提取、酶切、接頭的連接、預擴增（PCRⅠ）、選擇性擴增（Ⅱ）、電泳分離、銀染檢測等。該技術避免了RFLP和RAPD的缺點，同時結合了兩者的優(yōu)點，其分辨率高、重演性好、多態(tài)性豐富，從某種意義上說，AFLP技術的出現(xiàn)是DNA分子標記檢測技術的重大突破。田雷等[11]對AFLP標記技術在大白菜種子真實性及品種純度鑒定中的應用效果進行了探討，利用某引物組合擴增出的DNA圖譜可以將供試的5個雜交種及其8個親本全部區(qū)分開，從而可用此引物組合來鑒定雜交種和進行親本純度的鑒定；田雷等[12]還利用AFLP方法對5個甘藍雜交組合及其10個親本共15個材料進行了分析研究，從32個引物組合中篩選出1個引物組合，能夠對5個供試甘藍雜交種的真實性及品種純度進行鑒定，從而證明了AFLP技術在甘藍種子真實性及品種純度鑒定中的可行性。

AFLP標記技術優(yōu)點：a.標記異常豐富，典型的AFLP反應中，1次可檢測 100～150個擴增產物；b.穩(wěn)定性、重復性、共顯性表達，不受環(huán)境影響，無復等位效應；c.多態(tài)性很少、待測樣品也較少的情況下（如近等基因系和BSA分析）用AFLP標記能達滿意的結果；d.帶紋豐富，靈敏度高，快速高效。但是，AFLP標記也有缺點：a.其是一種專利技術，受專利權保護；b.實驗操作難度大，基因組的不完全酶切會影響實驗結果，所以實驗對DNA純度和內切酶的質量要求較高，需同位素或非同位素標記引物，昂貴費時，一般實驗室難以完成。因此在短時間內很難推廣應用在種子的純度檢驗上。從長遠看，AFLP是一種很有希望的種子純度檢驗技術。

④SSR技術 在動植物基因組中分布著許多1~10 bp的簡單重復序列（SSR），由于不同種或品種間重復單位的數(shù)目及重復單位序列的差異使基因組DNA產生大量的多態(tài)性。其技術流程包括基因組DNA的提取、PCR擴增、電泳分離、多態(tài)性檢測等。該技術比RFLP檢測到的多態(tài)性要多得多，并且減少了酶切、探針制備和DNA分子雜交等繁瑣程序，也是一種較為理想的DNA標記技術。到目前為止，SSR技術已在許多作物品種鑒定和純度檢測上得到應用。劉勤紅等[13]篩選了217對異源四倍體棉花的SSR引物，獲得了十幾個足以區(qū)分魯棉研15號父母本及其F1代的顯性標記位點，為魯棉研15號雜交種的純度鑒定提供了一個準確、穩(wěn)定和快捷、實用的方法；蘇順宗等[14]篩選出一批在常規(guī)水稻親本上具有較高多態(tài)性的SSR引物，并與田間純度鑒定結果進行研究比較，結果表明，SSR鑒定的平均純度與田間鑒定結果無顯著性差異，SSR可以用于雜交水稻種子純度的鑒定；李曉結合單籽粒DNA快速提取方法，快捷、準確地鑒定了玉米雜交種蜀雜6號的種子純度；王風格等[15]從DNA提取、PCR擴增、電泳檢測等環(huán)節(jié)對SSR技術進行了優(yōu)化，最終建立了一套完善的適用于玉米品種鑒定的SSR標準體系。

SSR技術優(yōu)點：a.數(shù)量豐富，覆蓋整個染色體組；b.具有多等位基因特性，信息含量高；c.以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；d.易于利用PCR技術分析，對DNA數(shù)量及純度要求不高，結果重復性好；e.每個位點由引物序列順序決定，便于交換。SSR技術最大的缺點是必須對重復序列兩端的保守序列進行尋找和分析，從而設計出同兩端保守序列互補的引物，這限制了該技術在大多數(shù)檢驗機構中的普及應用[16]。但一旦開發(fā)出一套某種生物的微衛(wèi)星標記，其他的研究工作者將受益無窮。

4 總結及展望

形態(tài)標記鑒定法作為經典傳統(tǒng)的鑒定方法，現(xiàn)階段仍是國內應用最廣泛和最方便的種子純度鑒定方法，隨著科學的不斷發(fā)展，這種傳統(tǒng)方法自身也在不斷完善和改進，但是受人為因素限制和外在環(huán)境影響，形態(tài)鑒定法發(fā)展的空間有限，在未來只能通過不斷地修訂和改進，獲得有限的進步。生化標記鑒定法和DNA分子標記鑒定法作為較為領先的種子純度鑒定技術，擁有更加廣闊的發(fā)展空間，是更加準確的鑒定方法。但是受現(xiàn)階段科學技術和實驗水平的限制，生化標記鑒定和DNA分子標記鑒定仍未能被廣泛利用在實踐生產中，在不久的將來，其有可能替代傳統(tǒng)的鑒定方法，并且更廣泛地應用到實際生產中。

綜上，每一種方法都有其自身的優(yōu)缺點，至今還沒有一種鑒定方法能夠比較全面、準確、快速、經濟地進行種子純度檢驗。所以，現(xiàn)階段的種子純度鑒定仍然是以形態(tài)標記、生化標記和DNA分子標記結合進行綜合的鑒定。

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