于志君，朱曉文，劉 紅，李 碩，范寶靜，王世申，吳 靜，武艷麗，王鐵成，楊松濤，黃 耕，高玉偉，夏咸柱＊

（1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人畜共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130122；3.長(zhǎng)春市疾病預(yù)防控制中心，吉林 長(zhǎng)春 130033）

A型流感病毒（Influenza A virus）在我國(guó)亦稱甲型流感病毒，屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），是單股負(fù)鏈RNA病毒[1]。該病毒的基因組由8條分節(jié)段的RNA片段組成，共編碼11種蛋白[1]。根據(jù)病毒血凝素（haemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性的不同，A型流感病毒被分為16種HA亞型和9種NA亞型[1]。雁形目（Anseriformes）和鸻形目（Charadriformes，如海鷗和岸禽）的水禽是A型流感病毒的自然宿主[2－3]，目前已知的A型流感病毒所有亞型均能從鳥類體內(nèi)分離出來(lái)[3]。

歷史上共發(fā)生過(guò)4次流感大流行，分別是1918年的西班牙流感、1957年的亞洲流感、1968年的香港流感和2009年的甲型H1N1流感。2009年甲型H1N1流感疫情的暴發(fā)改變了人們之前對(duì)流感大流行的認(rèn)識(shí)，以往人們普遍認(rèn)為下一次流感大流行一定是由一種新的亞型流感病毒引起。迄今為止，包括2009年甲型H1N1流感大流行在內(nèi)的所有流感大流行均是由A型流感病毒引起，因此研究A型流感病毒致病性機(jī)制可以為人們制定流感病毒防控和治療策略提供參考。另外，自從1997年香港首次報(bào)道人類感染H5N1亞型高致病性禽流感病毒后，動(dòng)物流感病毒跨越種屬障礙感染人的事件便時(shí)有發(fā)生，對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅，引起人們對(duì)A型流感病毒跨種傳播的關(guān)注。目前研究發(fā)現(xiàn)，A型流感病毒的跨種傳播和致病性主要受聚合酶蛋白、血凝素蛋白影響，因此本文將討論的焦點(diǎn)主要集中在以上兩種蛋白上，另外非結(jié)構(gòu)蛋白1和PB1－F2蛋白對(duì)流感病毒的致病性也有一定的影響。

1 聚合酶蛋白

1.1 對(duì)流感病毒跨種傳播的影響

1.1.1 調(diào)控病毒的溫度敏感性 若流感病毒PB2蛋白第627位氨基酸為賴氨酸（K），則該毒株可以在哺乳動(dòng)物上呼吸道內(nèi)有效復(fù)制，若PB2蛋白第627位氨基酸為谷氨酸（E），則該毒株不能在哺乳動(dòng)物上呼吸道內(nèi)有效復(fù)制[4]。體外試驗(yàn)證明，PB2－E627K突變?cè)跍囟葹?3℃時(shí)可以增強(qiáng)病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的復(fù)制能力，但37℃和41℃時(shí)則不能[5]。從這些試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，流感病毒可以通過(guò)聚合酶蛋白上氨基酸突變來(lái)改變毒株的溫度敏感性，調(diào)控A型流感病毒的跨種傳播。

1.1.2 調(diào)控入核轉(zhuǎn)運(yùn) 研究人員采用基因沉默技術(shù)發(fā)現(xiàn)入核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α與流感病毒的復(fù)制有關(guān)[6－8]。入核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α主要與流感病毒的聚合酶蛋白進(jìn)行結(jié)合，介導(dǎo)該類蛋白的入核轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。研究者在研究一株名為SC35M的流感病毒鼠適應(yīng)株時(shí)發(fā)現(xiàn)，該病毒的PB2－D701N突變和NP－N319K突變可以顯著增強(qiáng)病毒蛋白與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的入核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α1之間的結(jié)合能力。另外，有研究表明PB2－D701N突變也可以通過(guò)促進(jìn)PB2聚合酶蛋白上核定位信號(hào)的暴露來(lái)增加病毒PB2蛋白與入核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α之間的結(jié)合[9]。研究表明，流感病毒聚合酶蛋白對(duì)入核轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的適應(yīng)可能在流感病毒跨種傳播過(guò)程中扮演了重要的角色[10]。

1.2 對(duì)流感病毒致病性的影響

流感病毒聚合酶蛋白可以通過(guò)直接影響病毒的復(fù)制效率來(lái)改變病毒的致病性。研究者在研究一株名為SC35的H7N7亞型高致病性禽流感病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)，該病毒對(duì)小鼠致病力的強(qiáng)弱受病毒PB2蛋白調(diào)控[11]。研究者將SC35適應(yīng)小鼠后得到SC35鼠適應(yīng)株（SC35M），測(cè)序和序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，SC35M病毒蛋白上的多個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生置換，為了鑒定出與病毒致病性增強(qiáng)有關(guān)的氨基酸置換，研究者采用反向遺傳技術(shù)拯救出具有不同氨基酸置換位點(diǎn)的SC35流感病毒并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與SC35母本毒株相比，發(fā)生PB2－D701N、PB2－S714R和PA－K615N氨基酸置換的流感病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的復(fù)制效率顯著提高，而在禽類細(xì)胞上的復(fù)制效率則顯著下降，并且具有上述氨基酸置換的流感病毒對(duì)小鼠的致病性也顯著增強(qiáng)，因此，研究者認(rèn)為，該病毒的聚合酶蛋白通過(guò)影響病毒的復(fù)制效率來(lái)改變病毒的致病性。流感病毒PB2－D701N突變還會(huì)影響病毒的傳播性。研究者在研究一株名為DKGX／35的H5N1亞型禽流感病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)該毒株P(guān)B2蛋白第701位氨基酸為谷氨酰胺（N）是該病毒能夠在豚鼠間進(jìn)行有效傳播的前提條件[12]。除了PB2－D701N 突變外，PB2－E627K突變也與流感病毒的致病性密切相關(guān)[13－14]。通常情況下，禽流感病毒PB2蛋白第627位為谷氨酸（E），而人流感病毒為賴氨酸（K）。研究證實(shí)，H5N1亞型禽流感病毒PB2蛋白上第627位氨基酸若為谷氨酸（E），則該毒株對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)致病性，但如果該位點(diǎn)為賴氨酸，則毒株接種小鼠后可以引起小鼠全身性感染并導(dǎo)致小鼠發(fā)病死亡[13]。研究者發(fā)現(xiàn)禽流感病毒在小鼠身上傳一代即可獲得PB2－E627K突變[4，15]，而一些從人類感染者體內(nèi)分離出的 H5N1亞型禽流感病毒也具備 PB2－E627K 突變[16－17]，這些發(fā)現(xiàn)都表明PB2－E627K突變與流感病毒致病力的改變密切相關(guān)。另外，流感病毒PB2－E627K突變也會(huì)影響病毒的傳播性[18]。

測(cè)序發(fā)現(xiàn)甲型H1N1流感病毒PB2蛋白第627位和第701位氨基酸殘基都為“禽型”氨基酸（PB2－701D，PB2－627E）[19]，為了證明這是否是導(dǎo)致該病毒對(duì)人致病性較弱的原因，研究者通過(guò)反向遺傳技術(shù)在這兩個(gè)位點(diǎn)上引入PB2－E627K突變和PB2－D701N突變，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變后的流感病毒對(duì)小鼠和雪貂的致病性均未增強(qiáng)[20]，說(shuō)明這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)不能影響甲流病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性。近來(lái)經(jīng)證實(shí)，PA－E298K突變可以顯著增強(qiáng)甲型H1N1流感病毒對(duì)小鼠的致病力[21]，不過(guò)該氨基酸位點(diǎn)是否是甲型H1N1流感病毒惟一的毒力決定子尚有待進(jìn)一步研究。

2 血凝素

2.1 對(duì)流感病毒跨種傳播的影響

由于不同宿主細(xì)胞表面的受體類型存在差異，因此某種流感病毒能夠感染的宿主范圍受病毒血凝素受體結(jié)合特異性調(diào)控[22]。人流感病毒具有α2，6交聯(lián)唾液酸受體結(jié)合特異性（又稱“人型”受體結(jié)合特異性），因此易感染分布有α2，6交聯(lián)唾液酸受體的人呼吸道上皮細(xì)胞，而禽流感病則具有α2，3交聯(lián)唾液酸受體結(jié)合特異性（又稱“禽型”受體結(jié)合特異性），因此易感染分布有α2，3交聯(lián)唾液酸受體的禽腸道上皮細(xì)胞[23－25]。對(duì)于不同亞型流感病毒而言，其血凝素蛋白上調(diào)控受體結(jié)合特異性的氨基酸位點(diǎn)并不相同。對(duì)H1亞型流感病毒而言，若其血凝素第190位（文中出現(xiàn)的血凝素上氨基酸位點(diǎn)的位置均相對(duì)于H3亞型流感病毒而言）和第225位氨基酸殘基為天冬氨酸（D），則該毒株具有“人型”受體結(jié)合特異性，若其血凝素第190位氨基酸殘基為谷氨酸（E）、第225位氨基酸殘基為甘氨酸（G），則該毒株具有“禽型”受體結(jié)合特異性；對(duì)H2、H3亞型流感病毒而言，若其血凝素第226位氨基酸殘基為亮氨酸（L）、第228位氨基酸殘基為絲氨酸（S），則該毒株具有“人型”受體結(jié)合特異性；若其血凝素第226位氨基酸殘基為谷氨酰胺（N）、第228位氨基酸殘基為甘氨酸（G），則該毒株具有“禽型”受體結(jié)合特異性[26]。

目前，科學(xué)家們已經(jīng)采用糖芯片（carbohydrate microarrays）技術(shù)研究了甲型H1N1流感病毒的受體特異性。其中一項(xiàng)研究結(jié)果顯示該病毒只能夠與α2－6交聯(lián)唾液酸序列結(jié)合[27]，然而另外一項(xiàng)采用了其他糖芯片進(jìn)行研究的試驗(yàn)結(jié)果則顯示該病毒也能夠與包含α2－3交聯(lián)唾液酸序列的探針結(jié)合，但仍以α2－6交聯(lián)唾液酸受體特異性為主。因此，流感病毒大流行株對(duì)血凝素受體結(jié)合特異性的要求并沒(méi)有大的改變，即流感病毒仍然需要具有“人型”受體結(jié)合特異性才能在人群中引發(fā)流感疫情。

近年來(lái)，H5N1亞型流感病毒跨種傳播感染人的事件頻頻發(fā)生，死亡率接近60%。但從這些患者體內(nèi)分離出的H5N1亞型流感病毒的受體結(jié)合特性沒(méi)有發(fā)生任何改變，即仍偏向于結(jié)合α2，3受體（“禽”型受體）[13]。另外，盡管 H5N1亞型流感病毒的致死率較高，但該亞型病毒并不能在感染者與接觸者之間進(jìn)行有效傳播，以上兩點(diǎn)再一次證明流感病毒需要具有“人型”受體結(jié)合特異性才能在人群中進(jìn)行有效地傳播。

2.2 對(duì)流感病毒致病性的影響

血凝素蛋白水解酶活性是流感病毒的一個(gè)主要毒力決定子。因?yàn)橹挥醒厍绑wH0被宿主體內(nèi)存在的蛋白水解酶裂解為HA1和HA2而暴露出HA2氨基端的融合肽后，病毒囊膜才能與宿主細(xì)胞膜進(jìn)行融合，感染宿主細(xì)胞。高致病性禽流感病毒（HPAIV）對(duì)禽類的高致病性與其血凝素前體H0的高蛋白水解酶活性密切相關(guān)[28]。對(duì)于低致病性禽流感病毒（LPAIV），其血凝素裂解位點(diǎn)處只有一個(gè)精氨酸（R），只能被宿主類胰蛋白酶裂解，而這類酶只分布在少數(shù)幾個(gè)臟器中，故限制了病毒對(duì)組織臟器的感染；而高致病性禽流感病毒則不同，它們的血凝素前體H0的裂解位點(diǎn)處為多個(gè)堿性氨基酸，可以被多種酶類（如弗林蛋白酶和PC6蛋白酶）裂解。不過(guò)目前人們只在高致病性禽流感病毒中發(fā)現(xiàn)多堿性裂解位點(diǎn)，尚沒(méi)有從人群中分離出血凝素上帶有多堿性裂解位點(diǎn)的人流感病毒。

3 非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）對(duì)流感病毒致病性的影響

A型流感病毒的致病性與其逃避機(jī)體免疫應(yīng)答的能力密切相關(guān)，而非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）在病毒逃避機(jī)體免疫的過(guò)程中起著重要的作用。NS1蛋白最重要的功能是頡頏干擾素（IFN）。NS1蛋白主要通過(guò)兩種途徑來(lái)發(fā)揮干擾素頡頏劑功能以消除機(jī)體對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答：①通過(guò)NS1蛋白與雙鏈RNA的結(jié)合來(lái)抑制I型干擾素激活物——雙鏈RNA激活蛋白激酶（double－stranded RNA－activated protein kinase）的活化；②NS1蛋白可以通過(guò)阻止流感病毒的病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）識(shí)別類維生素A誘導(dǎo)基因1（retinoid inducible gene－1，RIG－1）等途徑，抑制刺激干擾素合成的轉(zhuǎn)錄因子的活化。

NS1蛋白上的某些氨基酸殘基與流感病毒的毒力密切相關(guān)。如果H5N1亞型高致病性禽流感病毒NS1蛋白第92位氨基酸是谷氨酸（E），則該毒株對(duì)小鼠有致病性，如果是天冬氨酸（D），則對(duì)小鼠無(wú)致病性。體外試驗(yàn)證明，如果NS1蛋白第92位氨基酸是谷氨酸（E），則該毒株可以在存在干擾素的細(xì)胞上復(fù)制，并且對(duì)豬有致病性。同樣，當(dāng)一株H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白上發(fā)生NS1－P42S突變后，該毒株對(duì)小鼠的毒力顯著增強(qiáng)，并且在體外試驗(yàn)中該突變株可以減少α干擾素和β干擾素的產(chǎn)量。在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，H5N1亞型禽流感病毒的NS1蛋白上若發(fā)生NS1－L103F 和 NS1－I106M突變，則NS1蛋白與細(xì)胞前體mRNA加工處理蛋白－切割及多聚腺苷酸化特異性因子30（cleavage and polyadenylation specificity factor 30，CPSF30）的結(jié)合能力增強(qiáng)，同時(shí)病毒的復(fù)制能力也顯著增強(qiáng)，研究者由此推斷流感病毒能夠通過(guò)NS1蛋白來(lái)抑制α干擾素和β干擾素前體mRNA的表達(dá)，從而提高病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制能力。

有研究顯示，盡管甲型H1N1亞型流感病毒能夠抑制干擾素的表達(dá)，但是該病毒的NS1蛋白卻不能與CPSF30結(jié)合[29]。然而，將甲型H1N1亞型流感病毒NS1蛋白108、125和189三處位點(diǎn)上的氨基酸突變成其他人流感病毒在相同位點(diǎn)處所共有的保守氨基酸后，變異株對(duì)小鼠和雪貂的毒力減弱，表明該病毒的NS1蛋白可以調(diào)控其毒力，因此研究NS1蛋白的生物學(xué)活性可能有助于我們探究A型流感病毒致病性的分子機(jī)制。

另外，NS1蛋白的羧基端也會(huì)影響流感病毒的致病性，但具體機(jī)制尚待研究。1918年西班牙流感病毒和H5N1亞型高致病性禽流感病毒的羧基端都有一段由4個(gè)羧基端氨基酸組成PDZ配體區(qū)，當(dāng)把這個(gè)PDZ配體區(qū)引入到鼠適應(yīng)性流感毒株后，可以增強(qiáng)鼠適應(yīng)株對(duì)小鼠的毒力。雖然我們尚不知道NS1蛋白PDZ配體區(qū)的致病機(jī)制，但是這個(gè)PDZ配體區(qū)應(yīng)該與NS1蛋白的抗干擾素作用無(wú)關(guān)。

4 PB1－F2蛋白對(duì)流感病毒致病性的影響

PB1－F2蛋白是由PB1基因＋1讀碼框編碼的小蛋白，共有90個(gè)氨基酸。PB1－F2蛋白具有調(diào)控流感病毒感染早期的病毒毒力和誘導(dǎo)繼發(fā)性細(xì)菌感染的功能。PB1－F2蛋白能夠和線粒體的電依賴陰離子通道1（VDAC－1）及腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（ANT3）相互作用，破壞細(xì)胞線粒體，促進(jìn)免疫細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)1918年西班牙流感病毒和H5N1亞型高致病性禽流感病毒PB1－F2蛋白上發(fā)生PB1－F2－S66N突變后，這兩株毒株對(duì)小鼠的毒力減弱，而當(dāng)發(fā)生N66S突變時(shí)，病毒對(duì)小鼠的致病性則顯著增強(qiáng)。甲型H1N1流感病毒的PB1－F2蛋白由11個(gè)氨基酸組成，缺失了一段氨基酸。而且不論是引入 PB1－F2－66N 還是 PB1－F2－66S，甲型 H1N1亞型流感病毒對(duì)小鼠及雪貂的毒力都沒(méi)有明顯增強(qiáng)，也不會(huì)使小鼠更易出現(xiàn)由肺炎鏈球菌介導(dǎo)的繼發(fā)性細(xì)菌感染[30]。

5 小結(jié)

A型流感病毒每年都在發(fā)生變異，對(duì)公共安全構(gòu)成嚴(yán)重危害，因此，研究A型流感病毒跨種傳播和致病性的分子機(jī)制可以為防控流感疫情提供理論基礎(chǔ)。目前的研究發(fā)現(xiàn)該型病毒的跨種傳播和致病性主要受病毒的聚合酶蛋白、血凝素蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白影響，但病毒的其他蛋白是否也對(duì)病毒有影響還在進(jìn)一步的研究中。另外，雖然目前甲型流感疫情已經(jīng)過(guò)去，但有證據(jù)表明甲型H1N1亞型流感病毒的聚合酶蛋白和NS1蛋白并沒(méi)有充分適應(yīng)人類宿主，這表明該病毒的流行性和潛在致病性可能還沒(méi)有被完全耗盡，而且根據(jù)以往流感病毒的流行規(guī)律，甲型H1N1流感病毒還會(huì)在人群中循環(huán)相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間，不能排除該病毒通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間抗原漂移或基因重組而產(chǎn)生毒力和傳播性更強(qiáng)的變異株的可能，因此應(yīng)繼續(xù)對(duì)已出現(xiàn)的流感毒株進(jìn)行分析，并深入研究影響A型流感病毒跨種傳播和致病性的病毒蛋白，為預(yù)測(cè)具有潛在流行性的毒株奠定基礎(chǔ)。

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