賈清華 張萬義 高 華 (北京市西山醫(yī)院,北京 0044)

凋亡所致的心肌細胞死亡與慢性充血性心力衰竭(CHF)密切相關(guān)〔1,2〕。細胞凋亡的調(diào)控涉及許多基因,Bcl-2基因家族是目前最受重視的調(diào)控細胞凋亡的基因家族,屬于一類新的癌基因家族〔2〕,許多研究表明 Bcl-2是抑制凋亡的主要基因。近年來研究采用中醫(yī)藥對心肌細胞凋亡干預手段來防治 CHF。本試驗以腹主動脈結(jié)扎所致CHF觀察對模型大鼠的Bcl-2基因蛋白表達、心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性 Wistar大白鼠 40只,購自山東大學實驗動物中心,體重 250～300g。

1.1.2 主要試劑與藥品

1.1.2.1 主要試劑 DeadEndTM熒光 TUNEL試劑盒(美國Promega公司);Bcl-2兔多克隆抗體(美國 Santa Cruz公司);PV-6001二步法免疫組化檢測試劑盒、濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司);DNase I(RNase Free)和 DNase I Buffer(大連保生物工程有限公司);Propidium Iodide(美國 Sigma公司),Anti-Mouse Cy3(Clontech公司)。

1.1.2.2 實驗藥品 參芪強心口服液(主要包含黨參、炙黃芪、柴胡、當歸、川芎等),含生藥材 2.63g/ml(由勝利醫(yī)院制劑室制備)?？ㄍ衅绽?上海醫(yī)藥集團有限公司,批號:030104)。

1.2 方法

1.2.1 慢性心衰模型制備 取 Wistar大鼠,10%水合氯醛0.3ml/100 g腹腔注射麻醉,固定,消毒,經(jīng)腹正中線開腹,縱向切口約 2cm,鈍性分離暴露腹主動脈。以直徑為 0.7 mm的不銹鋼探針與腹主動脈一起結(jié)扎。然后小心抽出探針形成腹主動脈狹窄(約 50%),同時腹腔一次性注射 10萬單位青霉素,關(guān)腹縫合。假手術(shù)組除絲線不結(jié)扎外,其余操作均同模型組。

將造模動物分籠,常規(guī)飼養(yǎng),大鼠腹主動脈縮窄法并加以改良制作慢性心衰動物模型4 w后出現(xiàn)氣喘、尿少、食欲下降、水腫、爪甲發(fā)紺等癥狀和體征。與對照組比較食量下降,尿量減少,水腫、爪甲發(fā)紺明顯,心電圖顯示心率加快。與臨床 CHF癥狀體征相似,病理切片見心、肝、肺組織形態(tài)上分別出現(xiàn):左心室心肌肥厚,肌纖維排列紊亂或斷裂、炎癥,肝臟微血管擴張、瘀血,肺泡壁破裂融合,間質(zhì)水腫、充血、此時提示 CHF大鼠模型成功。

1.2.2 實驗分組和給藥方法 4w后將實驗動物隨機分組,將模型動物分為 3組,分別為CHF模型組,強心口服液組和卡托普利組,另將假手術(shù)組作為空白對照組,每組均為 10只。強心口服液組按 5.26 g/200 g生藥的劑量灌服;卡托普利組按5.0mg/200g劑量灌服;假手術(shù)組灌胃2.0ml/200g生理鹽水,連續(xù)用藥 1個月后,分別檢測待查指標。

1.2.3 Bcl-2蛋白檢測 免疫組化檢測(PowerVision二步免疫組化法)Bcl-2蛋白。陽性標準:以細胞質(zhì)呈棕褐色為Bcl-2蛋白陽性表達。免疫組化在顯微鏡 200倍下用圖像分析系統(tǒng)測量平均光密度值(AOD),每組選 10個視野分別測量,然后計算均值作為此組的代表值。

1.2.4 心肌凋亡細胞檢測 末端標記原位細胞凋亡法(TUNEL)檢測心肌凋亡細胞。陽性標準:以細胞核呈綠色表示心肌凋亡細胞陽性,細胞核呈紅色表示心肌壞死。在顯微鏡400倍下觀察每個視野中的凋亡細胞數(shù),計算平均熒光強度,每個切片計數(shù) 4個視野,然后取其均值作為本組的代表值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行處理,數(shù)據(jù)以±s表示,采用單因素方差分析法(檢驗),組間比較采用 SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 參芪強心口服液對 CHF大鼠 Bcl-2蛋白表達的影響CHF模型組 Bcl-2蛋白表達與假手術(shù)組相比明顯降低,有顯著性差異(P＜0.05);強心口服液組與模型組相比,Bcl-2表達明顯增高,有顯著性差異(P＜0.05);卡托普利組 Bcl-2表達有增高的趨勢,但差異不顯著。見表 1,圖 1。

表1 參芪強心口服液對慢性心衰大鼠Bcl-2蛋白表達及細胞凋亡的影響(±s)

表1 參芪強心口服液對慢性心衰大鼠Bcl-2蛋白表達及細胞凋亡的影響(±s)

與假手術(shù)組相比:1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組相比:3)P＜0.05

組別 n Bcl-2(AOD) 凋亡細胞數(shù)假手術(shù)組 10 639.8±397.5 3.92±2.74模型組 10 319.6±153.91) 15.92±12.492)強心口服液組 10 486.2±160.93) 7.52±4.041)3)卡托普利組 10 416.3±268.0 9.03±5.101)3

2.2 參芪強心口服液對 CHF大鼠細胞凋亡的影響 模型組與假手術(shù)組相比,心肌組織細胞凋亡明顯增多,有極顯著性差異(P＜0.01);強心口服液組、卡托普利組與模型組相比,均能顯著降低慢性心衰大鼠的凋亡發(fā)生率,有顯著性差異(P＜0.05)。 見表 1,圖 2。

圖1 參芪強心口服液對慢性心衰大鼠Bcl-2蛋白表達的影響(×400)

圖2 參芪強心口服液對慢性心衰大鼠細胞凋亡的影響(×400)

3 討 論

黃芪擴張實驗小鼠冠狀動脈,改善心肌微循環(huán),增加冠脈血流量及心肌營養(yǎng)血流量,并對抗因垂體后葉素引起的心肌缺血;可擴張因去甲腎上腺素所致的金黃地鼠頰囊微血管的收縮,增加血管口徑。還可改善心肌營養(yǎng),降低心肌耗氧量,使氧的供需維持平衡,并可穩(wěn)定細胞膜,從而減輕心肌細胞的損傷。黨參能提高缺血/再灌注損傷心肌超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低丙二醛(MDA)含量,減少 CK的釋放,使心肌的收縮和舒張功能得到明顯改善,并能促進心輸出量、冠脈流量,每搏輸出量及心率的恢復,提示黨參對缺血/再灌注所致心肌脂質(zhì)過氧化損傷有一定的保護作用。研究表明〔3〕黨參具有增強心肌收縮力和改善左室舒張功能以及左室舒張期充盈增加的作用。當歸使離體兔心或麻醉狗冠脈擴張、血壓下降及心肌耗氧量減少,并緩解垂體后葉素性心肌缺血,心電圖 T波顯著降低〔4〕。當歸煎劑、水提取物及其有效成分阿魏酸鈉均能增加小鼠攝取86Rb的能力,使心肌營養(yǎng)性血流量明顯增加;當歸尚能擴張外周血管、降低血管阻力,使股動脈、腦動脈及冠狀動脈的血流量均增加,其作用機理可能與膽堿能受體和組胺受體興奮有關(guān);當歸及其有效成分阿魏酸鈉有抑制血小板聚集防止血栓形成作用,當歸水劑和阿魏酸鈉的有些體外抗血栓作用比阿司匹林還強;對凝血酶誘導的血小板聚集有明顯抑制作用,也能抑制3-5羥色胺(3H-5HT)從血小板中釋出,說明當歸和阿魏酸鈉抑制血小板聚集系統(tǒng)通過抑制血小板釋放反應(yīng)而產(chǎn)生,這可能與抑制血栓素 A2(TXA2)合成有關(guān);阿魏酸鈉還參與前列環(huán)素(PGI2)-TXA2平衡調(diào)節(jié)。川芎水提取物及其生物堿能擴張冠狀動脈增加冠脈血流量,改善心肌缺血;能降低小鼠心肌耗氧量;據(jù)研究川芎嗪也有改善左心功能的作用。知母雖不能直接改善心功能,但能顯著降低心率,有一定的降壓作用,降低大鼠血漿兒茶酚胺濃度,也說明知母有抗腎上腺素能的作用;其藥理效應(yīng)與美托洛爾相似〔5〕。

近年來的一些研究表明:心衰發(fā)生時左室功能的不斷惡化是心肌細胞凋亡或(和)剩余的心肌細胞收縮功能代償不足的結(jié)果。而凋亡可能是心肌細胞不斷丟失的根源所在 。細胞凋亡在心力衰竭中起到重要的作用,阻止細胞凋亡能減輕心臟重構(gòu)和心力衰竭的程度〔6〕。本實驗提示參芪強心口服液通過上述作用,保護心肌細胞,延緩或逆轉(zhuǎn)心力衰竭進程。

bcl-2基因是位于人濾泡性淋巴瘤的 t(14;18)染色體上的癌基因。Bcl-2基因及其蛋白可抑制多種組織的細胞凋亡,Surendran等通過Bcl-2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞,Bcl-2反義寡核苷酸處理細胞等方法證實 Bcl-2基因過高表達能明顯延長細胞壽命,減少細胞凋亡〔7〕。本研究表明參芪強心口服液通過調(diào)控心衰大鼠心肌細胞的凋亡基因Bcl-2等途徑抑制心肌細胞的凋亡。

1 Colucci WS.Molecular and cellular mechanisms of myocardial failure〔J〕.Am JCardiol,1997;80(11A):15-25.

2 Green DR,Kroemer G.The pathophysiology of mitochondrial cell death〔J〕.Science,2004;305(5684):626-9.

3 趙悅?cè)?多普勒測試黨參口服液對冠心病心功能改善的研究〔J〕.北京中醫(yī)藥大學學報,1996;19(3):49.

4 姜春華.活血化瘀研究新編〔M〕.上海:上海醫(yī)科大學出版社,1990:1,475.

5 胡宇馳,侯家玉 .知母、黃芪對小鼠實驗性心肌肥厚及應(yīng)激反應(yīng)能力的影響〔J〕.中國中藥雜志,2003;28(4):369-74.

6 Garg S,Narula J,Chandrashekhar Y.Apoptosis and heart failure:clinical relevance and therapeutic target〔J〕.JMol Cell Cardiol,2005;38(1):73-9.

7 Surendran S.Gopinathan P.Anti-apoptotic Bcl-2 gene transfection of human articular chondrocytes protects against nitric oxide-induced apoptosis〔J〕.J Bone Joint Surg Br,2006;88(12):1660-5.