趙俊峰 鄭少斌 姜耀東 楊旭凱 肖耀軍

(河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科,河南 鄭州 450002)

腎癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究中,G250是公認的腎透明細胞癌腫瘤相關(guān)抗原,但 G250基因在腎透明細胞癌發(fā)病中的作用尚不明確,多數(shù)研究結(jié)果顯示G250基因可能是一種癌基因〔1〕,并且參與了腎腫瘤細胞的生長與轉(zhuǎn)移〔2〕。為進一步了解該基因在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,本實驗利用RNA干擾技術(shù)阻斷 G250基因表達,觀察了沉默 G250基因?qū)δI癌 786-0細胞體外增殖及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人腎透明細胞癌 786-0細胞株(以下稱腎癌 786-0細胞)及大腸桿菌(DH5α)由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院泌尿外科保存。胎牛血清及 RPMI1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司),0.25%胰蛋白酶、碘化丙錠(PI)、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國 Sigma公司),二甲苯、多聚甲醛、檸檬酸鈉、蘇木素(成都化學(xué)試劑廠)。Biol-Rad酶聯(lián)免疫檢測儀(德國 BioRad公司),ELITE流式細胞儀(美國BECKMAN-COULTER公司)。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及siRNA轉(zhuǎn)染 G250 mRNA的全長序列從 NCBI基因庫(登錄號:AJ010588)檢索得出。應(yīng)用Primer express軟件按照siRNA設(shè)計原則尋找含 21個堿基的特異性序列,根據(jù)p RNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒的結(jié)構(gòu),設(shè)計出特異性干擾片段的核苷酸序列,并構(gòu)建重組質(zhì)粒(命名為pshRNA-G250)。在前期實驗的基礎(chǔ)上,選擇二條最有效的G250的siRNA片段,靶位點 970-990和 293-313。腎癌 786-0細胞培養(yǎng)時培養(yǎng)基為含 10%胎牛血清的 RPMI1640,置 37℃,95%飽和濕度,體積分數(shù)為 5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前 24 h,傳代至 24孔板,每孔 1.5×105個細胞。依說明書用 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后 6 h換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 轉(zhuǎn)染后腎癌 786-0細胞體外增殖實驗 將轉(zhuǎn)染后的 4組細胞(si-G250-a、si-G250-b、轉(zhuǎn)染陰性對照和空質(zhì)粒,分別命名為 786-0/si-G250-a、786-0/si-G250-b、786-0/si-G250-n和 786-0/si-G250-0),用 0.25%胰蛋白酶消化后用含 10%胎牛血清培養(yǎng)液配成單個細胞懸液,調(diào)整細胞濃度為 50 000個細胞/ml,以每孔 100μl接種到 96孔板,同時設(shè)置空白孔調(diào)零,以只加培養(yǎng)液不加細胞做比色對照。培養(yǎng) 12 h后,每孔加培養(yǎng)液補齊至100μl。終止培養(yǎng)前 4 h,每孔加 20μl 5 mg/ml的四氮唑藍鹽(MTT)溶液,在磁力攪拌器上混勻 30 min,繼續(xù)孵育 4 h,整個培養(yǎng)板上離心機,配平后開始低速離心 3 000 r/min,10 min后取下,小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加 100μl DMSO,室溫孵育 10min,微振蕩器振蕩 15 min,使結(jié)晶物充分溶解,用 Biol-Rad酶聯(lián)免疫檢測儀在 570 nm測光密度值(OD值)。每組設(shè) 3個重復(fù)孔,取平均值,以時間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)繪制重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 786-0細胞 1～7d后的細胞生長增殖曲線。

1.2.3 流式細胞術(shù)分析細胞周期 取生長狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)染72 h后的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及 pshRNA-G250-b(干擾效率最高)腎癌786-0細胞(分別命名為 786-0/si-G250-0和 786-0/si-G250-b細胞),待細胞密度達 80%～90%時,0.25%胰酶室溫消化,臺盼藍拒染法計數(shù)細胞,使收集細胞總數(shù)約 1×106,1 000 r/min,離心 10min,用冷 PBS洗兩次,緩慢加入 -20℃預(yù)冷的 70%乙醇1.5ml固定細胞,充分震蕩,使細胞分散,4℃保存待測。上機測定前離心去乙醇,用 PBS洗兩次,加 100μg/ml RNase 200μl,37℃消化 30 min。 PI 50μg/ml染色 30min,ELITE.流式細胞儀 488 nm激發(fā)波長、功率 15mW測定,用美國 PHEONIX公司的 Multicycle軟件分析細胞周期的分布,最后計算出細胞各期的百分數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理,數(shù)據(jù)均以±s表示,細胞周期變化兩組均數(shù)間的比較用兩獨立樣本 t檢驗,細胞體外增殖實驗采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 G250基因表達沉默對腎癌 786-0細胞體外增殖能力的影響 經(jīng)重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,四組之間差異顯著(F=360.170,P=0.000),多重比較得出四組細胞兩兩之間的差異除空白組和陰性組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.263),其余各組均有統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果說明 G250表達水平降低后,腎癌786-0細胞的體外增殖能力受到抑制。見圖 1。

2.2 流式細胞術(shù)分析細胞周期 Multicycle軟件分析 786-0/si-G250-0和 786-0/si-G250-b細胞流式細胞儀檢測細胞周期的分布,轉(zhuǎn)染干擾載體的 786-0/si-G250-b細胞較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的786-0/si-G250-0細胞的細胞周期分布發(fā)生較大變化,其主要改變表現(xiàn)為 G250基因表達降低后 G0/G1期細胞增多,而 S期、G2/M期細胞則減少。說明 G250基因表達降低后腎癌 786-0細胞出現(xiàn)了細胞周期的 G0/G1期阻滯。見表 1,圖 2。

圖1 實驗各組細胞體外MTT法增殖能力比較(OD值)

表1 流式細胞術(shù)分析 786-0/si-G 250-0和786-0/si-G 250-b細胞周期(±s,n=3,%)

表1 流式細胞術(shù)分析 786-0/si-G 250-0和786-0/si-G 250-b細胞周期(±s,n=3,%)

細胞系 G0/G1 S G2/M 786-0/si-G250-0 44.73±2.29 41.27±1.21 14.00±1.08 786-0/si-G250-b 59.97±3.26 32.83±2.73 7.17±1.40 t值 6.620 4.889 6.676 P值 0.003 0.008 0.003

圖2 流式細胞術(shù)分析 786-0/si-G250-0和786-0/si-G 250-b細胞周期分布

3 討 論

本實驗研究表明 G250基因表達沉默后,腎癌 786-0細胞體外增殖能力明顯減低,提示G250基因在促進細胞增殖、轉(zhuǎn)化方面有重要的作用〔1,3〕。體外細胞的增殖實驗發(fā)現(xiàn) G250基因表達沉默后,不僅腎癌786-0細胞體外增殖能力下降,而且隨著時間的延長表現(xiàn)出與對照組細胞體外增殖能力差異的加大,說明選擇 pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒作為載體構(gòu)建siRNA重組體的干擾效果穩(wěn)定。

資料顯示,惡性腫瘤細胞的基因表達和功能異常往往伴隨著廣泛的細胞周期調(diào)節(jié)失控,導(dǎo)致細胞分化受阻,使腫瘤細胞呈過度增殖狀態(tài)〔4〕。在細胞周期中,有 G0/G1、G1/S和 G2/M 3個調(diào)控點影響細胞周期,尤其是 G1→S期、G2→M期轉(zhuǎn)化過程,可使細胞周期停止,抑制細胞增殖,進入細胞周期的細胞也可發(fā)生凋亡而離開細胞周期。其中 G1調(diào)控點的存在可防止用損傷的DNA作為模板進行DNA復(fù)制,允許損傷的DNA在關(guān)鍵的細胞功能發(fā)生改變之前修復(fù),可增加細胞存活時間,限制帶有可遺傳的基因損傷的細胞增殖〔5〕。因此凡是影響腫瘤細胞增殖的作用都存在細胞周期的變化。本實驗發(fā)現(xiàn),G250基因表達降低后 G0/G1期細胞增多,而 S期、G2/M期細胞減少。說明G250基因表達沉默可以導(dǎo)致腎癌 786-0細胞G0/G1期阻滯,降低腎癌 786-0細胞 DNA的合成,從而抑制細胞生長和增殖,提示 G250基因與腎癌細胞的生長和增殖呈正相關(guān)。

多項研究發(fā)現(xiàn)在細胞周期的調(diào)控體系中,有多種因子參與,其中細胞周期蛋白的周期特異性、時相特異性積累與分解是確保周期有序變更的基礎(chǔ)〔6〕,包括 cyclin D1和 cyclin E1在G0/G1至 S期轉(zhuǎn)換中都起主要作用〔7,8〕,它們在 G1期進入 S期時高表達,與腫瘤細胞侵襲力、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔9〕。因此可以推斷 G250基因表達沉默影響細胞周期阻滯在G1期的主要機制可能是下調(diào) cyclin D1的表達,從而阻滯腎癌 786-0細胞 G0/G1期至S期的進程,抑制了細胞增殖。而很早以前的研究就已經(jīng)發(fā)現(xiàn) G250的cDNA轉(zhuǎn)染到小鼠的 NIH3T3成纖維細胞中可使細胞周期縮短,DNA合成增多〔10〕。所以真正的機制還有待進一步探討。

1 Zavada J,Zavadova Z,Pastorek J,et al.Human tumor-associated cell adhesion protein MN/CA IX:identification of M75epitope and of theregion mediating cell adhesion〔J〕.Br J Cancer,2000;82(11):1808-13.

2 Cho M,Uemura H,Kim SC,et al.Hypomethylation of the MN/CA9 promoter and upregulated MN/CA9 expression in human renal cell carcinoma〔J〕.Br JCancer,2001;85(4):563-7.

3 Mc Kiernan JM,Buttyan R,Bander NH,et al.Expression of the tumor-associated gene MN:a potential biomarker for human renal cell carcinoma〔J〕.Cancer Res,1997;57(12):2362-5.

4 劉秉文,陳俊杰.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)〔M〕.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2000:221-37.

5 Zhang J,Hua ZC.Targeted gene silencing by small interfering RNA-based knock-down technology〔J〕.Curr Pharm Biotechnol,2004;5(1):1-7.

6 Bahnassy AA,Zekri AR,Alam El-Din HM,et al.The role of cyclins and cyclins inhibitors in the multistep process of HPV-associated cervical car-cinoma〔J〕.J Egypt Natl Canc Inst,2006;18(4):292-302.

7 Stacey DW.Cyclin D1 serves as a cell cycle regulatory switch in actively proliferating cells〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2003;15(2):158-63.

8 Shariat SF,Ashfaq R,Sagalowsky AI,et al.Association of cyclin D1and E1expression with disease progression and biomarkers in patients with non-muscle-invasive urothelial cell carcinoma of the bladder〔J〕.Urol Oncol,2007;25(6):468-75.

9 Nauman A,Turowska O,Poplawski P,et al.Elevated cyclin Elevel in human clear cell renal cell carcinoma:possible causes and consequences〔J〕.Acta Biochem Pol,2007;54(3):595-602.

10 Pastorek J,Pastorekova S,Callebaut I,et al.Cloning and characterization of MN,a human tumor-associated protein with a domain homologous to carbonic anhydrase and a putative helix-loop-helix DNA binding segment〔J〕.Oncogene,1994;9(10):2877-88.