顧迎春 于曉玲 郭維軍 (淮陰醫(yī)院心內(nèi)科,江蘇 淮陰 223300)

缺血性心臟病是心血管疾病的多發(fā)病與常見病,目前保護(hù)缺血心肌最有效的方法是再灌注,即血管再通術(shù)。然而隨之帶來的再灌注心律失常、代謝異常以及心肌超微結(jié)構(gòu)的改變,即心肌的缺血再灌注損傷,直接影響病人的預(yù)后。多年來研究人員為減輕缺血再灌注損傷先后進(jìn)行了缺血預(yù)處理、缺氧預(yù)處理、藥物預(yù)處理等有效方法的研究,但因很難預(yù)測急性缺血事件的發(fā)生,預(yù)處理的臨床應(yīng)用受到限制。 2003年 Zhao等〔1〕首先提出缺血后處理(IPTC,經(jīng)典后處理)并證實(shí)其與預(yù)處理有類似的保護(hù)效果,但經(jīng)典后處理是一個(gè)附加的缺血干預(yù),操作復(fù)雜有創(chuàng),臨床應(yīng)用受限。而遠(yuǎn)程后處理操作簡單易行,如能證實(shí)有效,臨床上應(yīng)用前景將更為廣闊。本文旨在探討在體情況下,經(jīng)典后處理及遠(yuǎn)程缺血后處理對大鼠心肌缺血面積及超氧化物歧化酶(SOD)等的影響,為臨床尋找心肌缺血事件發(fā)生后的心肌保護(hù)方法提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 模型制作與分組 健康雄性 SD大鼠(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)40只,體重 250～300 g。大鼠用烏拉坦 1 g/kg麻醉,描記肢導(dǎo)心電圖,氣管插管,上呼吸機(jī),分離左側(cè)頸總動脈留用;沿左鎖骨中線縱行切開皮膚,分別在 2、3、4肋間隙進(jìn)針穿線,分開肋間隙和軟組織,剪斷肋骨,暴露心臟,以左冠狀動脈主干為標(biāo)志,在左心耳下緣 2～3 mm處進(jìn)針,5/0絲線穿過,用一長約 5mm,直徑 1.5 mm的乳膠管墊于血管與結(jié)扎線之間,打活結(jié),以收緊結(jié)扎線時(shí)S-T段抬高。放松后S-T段下降1/2以上為模型成功,關(guān)閉胸腔。40只大鼠隨機(jī)分四組,每組10只。①假手術(shù)組(空白組):開胸后穿線,不收緊扎線;②再灌注損傷組(I/R組):收緊結(jié)扎線,造成缺血 30 min;③IPTC組(后處理組):打活結(jié)結(jié)扎 30 min,再通 10 s,結(jié)扎 10 s重復(fù) 4次;④非創(chuàng)傷性雙下肢缺血后處理組(遠(yuǎn)程組),操作同IR組,在再灌注同時(shí)捆綁雙下肢 5 min,以不能觸及股動脈搏動為準(zhǔn),松開 5 min,反復(fù) 3次,以上各組剪斷結(jié)扎線后均再灌 180 min。

1.2 檢測指標(biāo)及方法

1.2.1 心律失常評分 記錄缺血和再灌期間室早發(fā)生次數(shù),室速、室顫發(fā)生率及累計(jì)持續(xù)時(shí)間。參照文獻(xiàn)〔1〕進(jìn)行評分,0分:無室性心律失?；騼H發(fā)生室早,且 ＜5次 /min;1分:僅發(fā)生室早≥5次/min;2分:僅發(fā)生一陣室速且 ＜60 s;3分:發(fā)生一陣≥60 s的室速或發(fā)生多陣室速但累計(jì)時(shí)間≤60 s;4分:發(fā)生多陣室速且累計(jì)時(shí)間≥60s;5分:發(fā)生室顫但能夠自動恢復(fù);6分:出現(xiàn)不可恢復(fù)的室顫或在觀察期內(nèi)死亡。

1.2.2 心肌梗死范圍測量 取血畢,原位結(jié)扎冠狀動脈,1%伊文思藍(lán) 2ml由主動脈逆行注入左心室,剔出心房和右室及藍(lán)染區(qū)域,-20℃冰凍 20 min,取出后將心臟橫切成 1～2 mm的短軸切片,放入 1%TTC 0.1 mmol/L磷酸緩沖液中(pH值7.4)中,37℃孵育 20 min。TTC染色后梗死心肌不染色,呈灰白色,缺血區(qū)心肌呈紅色,分離后濾紙吸干,稱重,梗死范圍以壞死心肌重量與左室重量(壞死+非壞死)之比表示。

1.2.3 光鏡下觀察大鼠心肌形態(tài)改變 實(shí)驗(yàn)結(jié)束立即取下心臟,4%甲醛固定,從心尖始間距為 0.3cm橫向連續(xù)切片,石蠟包埋切片(5μm厚),HE染色,光鏡下觀察病理改變。

1.2.4 血清生化指標(biāo)測定 于 180 min再灌注末,頸總動脈取血 4ml,1 500 r/min離心 10min,取上清液,測定血中磷酸肌酸激酶(CK)、SOD、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)含量,各項(xiàng)均按試劑盒方法測定及計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以±s表示,采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 心律失常評分比較 缺血期及再灌注期間后處理組、遠(yuǎn)程組心律失常評分明顯高于空白組、I/R組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見表 1。

2.2 心肌梗死范圍測量 空白組壞死區(qū)重量為 0 g;I/R組、后處理組、遠(yuǎn)程組三組間左室重量相當(dāng);遠(yuǎn)程組、后處理組梗死范圍明顯低于 I/R組(P＜0.01),見表 2。

2.3 光鏡下觀察大鼠心肌形態(tài)改變 空白組心肌纖維染色均勻、橫紋清晰,心肌間質(zhì)未見出血壞死及炎性細(xì)胞浸潤;I/R組心肌組織有不同程度腫脹,心肌纖維斷裂,間質(zhì)有較多炎性細(xì)胞浸潤,肌間質(zhì)有瘀血;遠(yuǎn)程組與后處理組心肌細(xì)胞腫脹明顯減輕,心肌纖維呈波浪狀,肌漿分布不均勻,心肌間質(zhì)無出血,有少量炎性細(xì)胞浸潤,見圖 1。

表1 各組心律失常評分比較(n=10,±s,分)

表1 各組心律失常評分比較(n=10,±s,分)

與空白組比較:1)P＜0.01;與 I/R組比較:2)P＜0.01

組別 缺血期 再灌注期空白組 0.2±0.42 0.1±0.32 I/R組 1.2±1.031) 2.7±1.771)后處理組 1.1±0.881) 1.4±0.971)2)遠(yuǎn)程組 1.0±0.661) 1.5±0.841)2)

2.4 血清生化指標(biāo)測定 遠(yuǎn)程組及后處理組 CK、MDA含量明顯低于 I/R組;SOD、NOS含量明顯高于 I/R組,見表 3。

表2 大鼠梗死范圍、左室重量的比較(n=8,±s)

表2 大鼠梗死范圍、左室重量的比較(n=8,±s)

與 I/R組比較:1)P＜0.01

組別 壞死區(qū)(g)非壞死區(qū)(g)梗死范圍(%)左室重量(g)I/R組 0.175 4±0.194 0.281 2±0.032 4 38.50±4.41 0.457 9±0.334后處理組 0.114 4±0.1011)0.354 8±0.2281) 22.59±1.751) 0.469 2±0.254遠(yuǎn)程組 0.121 7±0.0771)0.316 4±0.023 91)27.78±1.971) 0.438 1±0.136

表3 各組大鼠血清生化指標(biāo)的比較(n=10,±s)

表3 各組大鼠血清生化指標(biāo)的比較(n=10,±s)

與空白組比較:1)P＜0.01;與 I/R組比較:2)P＜0.05,3)P＜0.01

組別 CK(U/L) SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) NO(μmol/ml) NOS(nmol/ml)空白組 38.29±11.94 75.7±6.90 4.07±0.95 102.06±18.71 45.24±6.37 I/R組 183.99±32.911) 38.53±5.871) 10.86±1.881) 63.12±10.201) 28.88±4.561)后處理組 98.98±18.571)3) 60.17±6.331)3) 8.94±1.811)2) 76.96±13.331)2) 38.14±6.041)3)遠(yuǎn)程組 121.36±21.541)3) 58.39±7.281)3) 9.38±2.291)2) 77.22±15.891)2) 35.91±7.631)3)

圖1 各組心肌組織病理學(xué)觀察(HE)

3 討 論

本研究利用止血帶所致的肢體缺血,進(jìn)行非創(chuàng)傷性雙下肢缺血后處理(N-W IPTC)對大鼠心肌I/R進(jìn)行觀察,結(jié)果提示,N-W IPTC組與IPTC組的實(shí)驗(yàn)大鼠心肌梗死組織重量百分比比較無顯著性差異,而與I/R組比較,IPTC組和N-WIPTC組的大鼠心肌梗死組織重量百分比顯著減小,表明和 IPTC的心肌保護(hù)作用一樣,N-WIPTC也具有減少大鼠I/R心肌梗死面積的作用,推測其可能機(jī)制有:①反復(fù)捆綁和松開下肢,可刺激兒茶酚胺釋放增加,與受體結(jié)合后激活 G蛋白和磷脂酶 C,隨之活化蛋白激酶 C(PKC),上調(diào)熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄而顯示保護(hù)效應(yīng)〔2〕,②下肢捆綁后導(dǎo)致局部缺血缺氧,刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度增加,使 NO合成酶活化,產(chǎn)生并釋放 NO,NO可通過 cGMP含量增加而減少Ca2+內(nèi)流或抑制心肌細(xì)胞內(nèi) Ca2+釋放而發(fā)揮心肌保護(hù)作用,③下肢 I/R后處理過程中,局部缺血缺氧產(chǎn)生的氧自由基,產(chǎn)生與后處理相似作用,氧自由基在介導(dǎo) IPTC心肌保護(hù)起著重要作用〔3,4〕。

上述研究表明,在體大鼠 N-W IPTC能夠明顯縮小心肌梗死面積,即遠(yuǎn)程缺血后處理同經(jīng)典 IPTC一樣對I/R心肌具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與減輕氧自由基損傷,抑制鈣超載、保護(hù)血管內(nèi)皮、減輕微血管損傷和炎癥反應(yīng)等作用有關(guān)〔5〕,但其保護(hù)心肌的確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

1 Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition of myocardial injury by ischernic postconditioning during reperfusion;comparision with ischernic preconditioning〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003;285(2):579-88.

2 袁志柳,王藝明,沈 正,等 .非創(chuàng)傷性雙下肢缺血后處理對大鼠 I/R心肌梗死面積和 PKCa表達(dá)的影響〔J〕.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006;31(3):238-40.

3 Pain T,Yang XM,Critz SD,et al.Opening of mitochondrial K(ATP)channels triggers the preconditioned state by generating free radicals〔J〕.Circ Res,2000;87(6):460-6.

4 Nakano A,Liu GS,Heusch G,et al.Exogenous nitric oxide can trigger a preconditioned statethrough a free radical mechanism,but endogenous nitric oxide is not a trigger of classical ischemic preconditioning〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2000;32(3):1159-67.

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