王金蘭 仲玉潔 (鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南 鄭州 45004)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘由少突膠質(zhì)細(xì)胞(OLG)形成〔1〕,髓鞘是神經(jīng)信號(hào)跳躍式傳導(dǎo)的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血容易導(dǎo)致腦白質(zhì)脫髓鞘,且這種變化與少突膠質(zhì)細(xì)胞損害密切相關(guān)〔2,3〕。髓鞘脫失,神經(jīng)傳導(dǎo)受到嚴(yán)重影響,導(dǎo)致機(jī)體學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙。標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物(EGb761,Ginkgo biloba extract 761)在治療學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙方面得到了肯定,但其相關(guān)作用機(jī)制的研究相對(duì)較 少。 2′3′-環(huán)核 苷酸 3′-磷 酸二酯酶(2′3′-cyclic nucleotide3′-Phosphode-esterase,CNPase)是一 種髓鞘標(biāo)志酶,而且在 OLG中含有高水平 CNPase。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)慢性腦缺血大鼠模型給予 EGb761進(jìn)行干預(yù),應(yīng)用 CNPase抗體標(biāo)記成熟OLG并觀察其表達(dá)情況,探討EGb761對(duì)老齡大鼠學(xué)習(xí)能力及腦OLG的影響,為其在認(rèn)知功能治療機(jī)制方面開辟新思路、提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 30只雄性 12月齡 SD大鼠,體重(400±30)g,由鄭州科大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成三組:假手術(shù)組,單純?nèi)毖M,EGb761干預(yù)組,每組 10只。

1.2 主要試劑與儀器 EGb761(達(dá)納康,按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物要求選取,內(nèi)含 24%的銀杏黃酮苷和 6%的萜烯內(nèi)酯),40 mg/粒,由法國(guó)博福-益普生制藥工業(yè)公司生產(chǎn);MG-2C/3C迷宮刺激器,由張家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠生產(chǎn);CNPase抗體(2′3′-環(huán)核苷酸 3′-磷酸二酯酶抗體),購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 慢性腦缺血模型鼠的制作 參考 Wakita等〔4〕方法制備動(dòng)物模型。10%水合氯醛(0.3 mg/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉后,頸部備皮、消毒,頸正中切開皮膚,切口約 1.5～2.0 cm,鈍性分離筋膜、胸骨舌骨肌,分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈,每側(cè)用雙線分別在近心端和遠(yuǎn)心端結(jié)扎,然后在兩結(jié)扎處之間剪斷頸總動(dòng)脈制備出單純?nèi)毖M和干預(yù)組模型,假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎,縫合切口,對(duì)皮并消毒,放回原環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.4 給藥方法 將達(dá)納康研成粉末狀,用蒸餾水溶解并混勻,術(shù)后 24h按照 0.5 ml/100g予灌胃,單純?nèi)毖M給予等量蒸餾水灌胃,各組灌胃均為每日一次,持續(xù) 12 w。

1.5 學(xué)習(xí)能力測(cè)試 大鼠的學(xué)習(xí)能力測(cè)試在呈三等分輻射狀的 Y迷宮中進(jìn)行,環(huán)境為安靜暗室。Y迷宮每臂頂端各裝一盞15 w的刺激信號(hào)燈,相應(yīng)臂的信號(hào)燈亮?xí)r,該臂不通電為安全區(qū),另外無(wú)燈光的兩臂及交界區(qū)均通以 50～70 V交流電而成為電擊區(qū)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí),讓大鼠在起步區(qū)(大鼠開始所在的臂)適應(yīng) 5 min,然后無(wú)規(guī)則次序變換安全區(qū),觀察動(dòng)物學(xué)會(huì)逃離電擊區(qū)而進(jìn)入安全區(qū)的反應(yīng)能力。規(guī)定大鼠在受電擊后10s內(nèi)一次性跑向安全區(qū)為正確反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中每次通電刺激的間隔時(shí)間為 30s。以大鼠連續(xù)訓(xùn)練 10次中出現(xiàn) 9次以上正確反應(yīng)作為學(xué)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn),以達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需總電擊次數(shù)表示學(xué)習(xí)成績(jī)。

1.6 標(biāo)本的收集與處理 大鼠經(jīng)麻醉后,常規(guī)生理鹽水及多聚甲醛灌注、固定,斷頭取腦,制作腦部冠狀石蠟切片(厚度4μm),采用免疫組化染色,檢測(cè)腦皮層、胼胝體及海馬 CNPase陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,應(yīng)用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)成績(jī)測(cè)試結(jié)果 大鼠學(xué)習(xí)成績(jī)測(cè)試結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠反應(yīng)良好,學(xué)習(xí)成績(jī)?yōu)?33.3±1.16);而單純?nèi)毖M大鼠表現(xiàn)反應(yīng)遲鈍,達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)明顯增多,成績(jī)?yōu)?68.3±2.06),與假手術(shù)組相比差異顯著(P＜0.01);EGb761干預(yù)組的學(xué)習(xí)成績(jī)(46.9±1.45)明顯好于單純?nèi)毖M,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 大鼠腦 OLG CNPase的變化情況 各組均取皮層、胼胝體、海馬處進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì) CNPase陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。單純?nèi)毖M CNPase陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于假手術(shù)組和 EGb761組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表 1。

表1 大鼠皮層、胼胝體、海馬 CNPase陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況(±s,n=10,個(gè)/400倍高倍鏡視野)

表1 大鼠皮層、胼胝體、海馬 CNPase陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況(±s,n=10,個(gè)/400倍高倍鏡視野)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與單純?nèi)毖M比較:2)P＜0.01

組別 皮層 胼胝體 海馬假手術(shù)組 9.7±1.34 27.8±1.93 7.7±0.95單純?nèi)毖M 4.8±1.031) 18.2±1.751) 3.9±0.881)干預(yù)組 7.1±1.12) 23.8±1.322) 5.7±0.822)

3 討 論

既往人們認(rèn)為腦白質(zhì)對(duì)缺血具有很高的耐受性,這一觀點(diǎn)影響著對(duì)缺血后膠質(zhì)細(xì)胞改變及機(jī)制的研究,近年發(fā)現(xiàn) OLG對(duì)缺血高度敏感〔5～7〕,影像學(xué)研究顯示老年人腦白質(zhì)改變非常常見,認(rèn)為與血管病變導(dǎo)致的慢性、持續(xù)性缺血有關(guān),而當(dāng)慢性腦缺血時(shí) OLG較神經(jīng)元更易受損。此外,與神經(jīng)元不同,膠質(zhì)細(xì)胞損害后具有較強(qiáng)的再生能力,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在室管膜周圍存在OLG前體細(xì)胞,在一定條件下它可以增殖、分化并遷移至損傷區(qū)域〔5〕,起修復(fù)的作用。所以,以白質(zhì)損害為主的病變具有較好的恢復(fù)潛力和更高的治療價(jià)值,保護(hù) OLG損害也對(duì)預(yù)防老年性白質(zhì)改變及相關(guān)的認(rèn)知功能降低具有重要價(jià)值〔2〕。

本文提示慢性腦缺血可造成學(xué)習(xí)認(rèn)知能力障礙。采用免疫組化 CNPase標(biāo)記OLG的方法觀察大鼠腦組織中 OLG的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,單純?nèi)毖M大鼠皮層、胼胝體、海馬內(nèi)的CNPase表達(dá)較假手術(shù)組顯著減少,提示OLG存在缺血易損性。

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) EGb761,含 24%的銀杏黃酮苷和 6%的萜烯內(nèi)酯等多種活性物質(zhì),其藥理作用較廣泛,可協(xié)同作用于有關(guān)氧化應(yīng)激、血液循環(huán)、神經(jīng)遞質(zhì)和炎癥反應(yīng)等不同的病理過(guò)程,是針對(duì)提高人的認(rèn)知功能應(yīng)用最廣泛的草藥制劑,在歐洲尤其盛行,德國(guó)官方批準(zhǔn)EGb761用于治療阿爾茲海默氏癥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EGb761提高模型大鼠定向?qū)W習(xí)記憶能力,其可能機(jī)制是通過(guò)抑制 OLG對(duì)缺血性損傷高度敏感的相關(guān)機(jī)制,包括氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸和凋亡通路激活等〔7〕,減輕 OLG在慢性腦缺血時(shí)的損傷、促進(jìn)其再生及修復(fù),減少髓鞘的脫失,從而改善神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo),改善學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙。

1 王新德,魏崗之.神經(jīng)病學(xué):神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性疾病〔M〕.北京:人民軍醫(yī)出版社,2003:1-238.

2 李昕華,徐忠信,王曉明,等.慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙大鼠神經(jīng)細(xì)胞 Caspase-3表達(dá)及 GDNF給藥的影響〔J〕.中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2008;21(3):224-6.

3 Onteniente B,Rasika S,Benchoua A,et al.Molecular pathways in cerebral ischemia:cues to novel therapeutic strategies〔J〕.Mol Neurobiol,2003;27(1):33-72.

4 Wakita H,Tominoto H,Akigauthi I,et al.Glia activation and white matter changes in the rat brain induced by chronic cerebral hypoperfusion:an immunohistochemical study〔J〕.Acta Neuropathol,1994;87(5):484-92.

5 王麗娟,徐 超.定量評(píng)估大鼠局灶性腦缺血再灌注后少突膠質(zhì)細(xì)胞的病理學(xué)變化〔J〕.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2010;23(1):28-30.

6 楊 晶,鄧 方,喬 松,等.慢性腦缺血對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)和腦白質(zhì)病理學(xué)變化的影響〔J〕.中國(guó)腦血管病雜志,2009;6(12):646-50.

7 Dewar D,Underhill SM,Goldberg MP.Oligodendrocytes and ischemic brain injury〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2003;23(3):263-74.