陳玉強(qiáng) 房學(xué)東 王躍生 孟凡石 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長春 3004)

缺血再灌注(I/R)損傷是在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后,組織器官的損傷反而加重的現(xiàn)象,是外科常見的一種損傷。由于小腸為體內(nèi)最大的細(xì)菌庫和淋巴庫,小腸I/R除了會引起局部組織的損傷外,更會由于細(xì)菌和毒素的釋放,移位到體循環(huán)而引起網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)生系列反應(yīng),發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和多器官功能障礙綜合征(MODS),是患者死亡的主要原因之一〔1〕。但是,細(xì)胞炎性介質(zhì)釋放的增加和細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生以及臟器損害的發(fā)生機(jī)制,至今為止還不清楚。本文擬通過探討腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時以及半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)表達(dá)的研究,對小腸缺血所引起的遠(yuǎn)隔臟器損害的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行分析,探尋一種全新的預(yù)防和治療腸系膜血管缺血性疾病導(dǎo)致ARDS和MODS的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 Caspase-8(1∶100)購自上海滬尚生物科技有限公司;TNF-α購自武漢博士德生物工程有限公司;Ultra SensitiveTM S-P超敏試劑盒(鼠/兔)和 DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 方法 健康雄性 Wistar大鼠 48只,清潔級,2～3月齡,體重 200～250 g,吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、對照組和實(shí)驗(yàn)組。10%水合氯醛腹腔注射(0.25 ml/100 g體重),麻醉滿意后,取仰臥位固定。腹部常規(guī)消毒后無菌條件下取腹正中切口約 3～4 cm入腹,將腸管推向左側(cè),游離腸系膜上動脈,以無創(chuàng)傷動脈夾夾閉腸系膜上動脈起始部,縫合切口〔2〕。60min后經(jīng)原切口進(jìn)腹,取出動脈夾,恢復(fù)血供。再灌注結(jié)束后,實(shí)驗(yàn)組動物給予腹腔注射 TNF-α(1.5 mg/100 g體重),對照組不給予腹腔注射 TNF-α,假手術(shù)組不予阻斷腸系膜上動脈。24 h后,所有大鼠脫頸處死,剪開胸腔,充分暴露肺臟,左肺進(jìn)行灌注固定,右肺立即取部分肺組織稱濕重(W)并記錄,而后置于 80℃烘箱烘干 48 h至恒重,稱干重(D),求得濕干比值(W/D)。左肺置于 10%甲醛中 4℃下固定 24 h后,酒精梯度脫水、二甲苯透明,石蠟包埋,切片,厚度2μm。采用鏈霉素菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP)免疫組織化學(xué)染色,按試劑盒操作說明進(jìn)行,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。在低倍鏡(40倍)下選取陽性表達(dá)密集區(qū),在高倍鏡(400倍)下觀察細(xì)胞形態(tài)、染色定位和程度。每組選取 6張切片,每張切片隨機(jī)選取 5個不同重疊視野,輸入計(jì)算機(jī)分析累積光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織 W/D值的變化 實(shí)驗(yàn)組肺組織的 W/D值(6.58±0.05)顯著高于正常組(3.18±0.03)、假手術(shù)組(3.21±0.02)和對照組(4.25±0.04)(均 P＜0.05);對照組肺組織 W/D較假手術(shù)組和正常組明顯升高(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠肺組織中 caspase-8免疫組織化學(xué)染色(×400)

2.2 肺組織 caspase-8的檢測 與對照組比較,實(shí)驗(yàn)組caspase-8表達(dá)增強(qiáng),主要分布在肺泡上皮細(xì)胞的胞漿,棕黃色,細(xì)顆粒狀,見圖 1。實(shí)驗(yàn)組 caspase-8累積光密度值(2 048.01±118.33)較對照組(1 201.08±85.34)差異顯著(P＜0.05);對照組較假手術(shù)組(451.21±57.63)和正常組(416.32±71.69)明顯升高(P＜0.05)。

3 討 論

小腸 I/R后的病理生理機(jī)制尚不清楚,學(xué)者們先后提出了一系列學(xué)說。由于毒素及各種細(xì)胞因子的釋放,通過血液循環(huán),遠(yuǎn)隔臟器受到損害,其中增加的 TNF-α是導(dǎo)致肺臟損害的主要因子之一,并且可以誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞的凋亡〔3〕。急性肺炎癥反應(yīng)與細(xì)胞因子表達(dá)和導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的信號級聯(lián)放大系統(tǒng)有關(guān)。這個級聯(lián)放大系統(tǒng)是通過 TNF-α激活的,TNF-α是調(diào)節(jié)必要生物學(xué)功能的細(xì)胞因子家族典型成員,對于外界壓力和刺激具有反應(yīng)〔4〕。它最初是通過免疫細(xì)胞,如單核和巨噬細(xì)胞釋放的,其他類型的細(xì)胞,包括腺泡細(xì)胞也能釋放。TNF-α與兩種細(xì)胞膜受體結(jié)合,即 TNF-α受體 1(TNFR1)和 TNF-α受體 2(TNFR2)。盡管多數(shù)細(xì)胞系和組織均表達(dá)兩種亞型,TNF-α的生物學(xué)活性主要通過 TNFR1調(diào)節(jié)。

靶細(xì)胞暴露到 TNF-α后,可能通過關(guān)閉自身受體下調(diào)它們對于細(xì)胞因子的反應(yīng)。為了結(jié)合循環(huán)中過量的 TNF-α,就要釋放可溶性的抗體,因此兩種可溶性受體(TNFR1和 TNFR2)比TNF-α具有更長的半衰期,它們的濃度能夠反應(yīng) TNF-α的活性〔5〕。TNF-α在炎癥過程中的始發(fā)作用已經(jīng)通過幾個細(xì)胞系、動物模型和人體實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證〔6～8〕。在炎癥反應(yīng)中,過量的TNF-α在炎癥基因誘導(dǎo)、細(xì)胞死亡、內(nèi)皮細(xì)胞的增加、免疫細(xì)胞的聚集和活化過程中具有關(guān)鍵作用〔9〕。

肺組織 W/D是目前常用的評價肺水腫和反映微血管損傷的指標(biāo),肺組織損傷后,微血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞間隙增大,導(dǎo)致肺泡腔內(nèi)大量炎性物質(zhì)滲出、集聚、出血及炎性細(xì)胞游走。因此,肺損傷后 W/D升高,而實(shí)驗(yàn)組 W/D值顯著高于正常組、假手術(shù)組和對照組,證明實(shí)驗(yàn)組大鼠肺損傷較重。

在凋亡的信號通路中,caspase-8作為凋亡受體誘導(dǎo)的第一個放大信號,在細(xì)胞凋亡過程中受到廣泛研究。Caspase-8是包含 480個氨基酸分子量為 55 kD的蛋白,在它的N端前結(jié)構(gòu)域包括 2個死亡效應(yīng)域(DED),在它的C端是一個蛋白酶催化劑結(jié)構(gòu)域。DED結(jié)構(gòu)的功能為蛋白之間相互作用提供平臺〔10〕。在蛋白水解反應(yīng)中,活化的caspase-8分子是由 2個大的和 2個小的亞基構(gòu)成的四聚體〔11〕。在失活狀態(tài)下,在大多數(shù)細(xì)胞中caspase-8是作為最開始半胱氨酸蛋白酶的酶原形式出現(xiàn)。凋亡發(fā)生后,通過激活的死亡受體,caspase-8通過聚合成聚合體成為活化狀態(tài)〔12〕。

在哺乳動物細(xì)胞中,主要存在兩種細(xì)胞凋亡途徑,即細(xì)胞外(受體)途徑和細(xì)胞內(nèi)(線粒體)途徑〔13〕。無論是細(xì)胞外還是細(xì)胞內(nèi)途徑的刺激都能導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶活化。半胱氨酸蛋白酶在進(jìn)化過程中是高度保守的家族,是細(xì)胞死亡各種形式常見的有效分子。一旦活化以后,它們切割胞漿或者胞核中的各種底物,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔11〕。在細(xì)胞外凋亡途徑中,TNF死亡受體的刺激導(dǎo)致 caspase-8活化,隨后直接切割下游有效半胱氨酸蛋白酶,如 caspase-3〔14〕。同時,活化的 caspase-8可能通過切割 Bid,連接受體到線粒體途徑。而 Bid是 Bcl-2家族蛋白,在切割后能產(chǎn)生 BH 3結(jié)構(gòu)域定位到線粒體,通過線粒體放大系統(tǒng)擴(kuò)大〔15〕。在線粒體途徑中,各種凋亡因子的釋放最終激活了 caspase-3〔16〕。而 caspase-3是該途徑的最后值行者,具有“殺手蛋白”之稱。

本研究表明 caspase-8活化后參與到小腸 I/R后 TNF-α誘導(dǎo)的肺損傷中,是TNF-α細(xì)胞信號通路中的重要一部分組成。抑制其表達(dá)活性,可能減輕腸系膜血管缺血性疾病導(dǎo)致的ARDS和 MODS。

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