楊書良 郝玉栓 李校天 李蘭梅 (河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河北 邯鄲 056029)

生理情況下,腸道通過諸多屏障機(jī)制有效地防止腸道細(xì)菌及其毒素越過腸黏膜屏障,侵入肝、腎和腸系膜淋巴結(jié)等器官〔1〕。但在腸道感染時(shí),腸黏膜屏障可受到損傷,引起腸道細(xì)菌易位〔2〕。 Walser等〔3〕報(bào)道,組胺受體阻斷劑可降低腸黏膜屏障的保護(hù)作用,增加腸道細(xì)菌易位的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)旨在通過小劑量、低濃度組胺腸道內(nèi)灌注,對(duì)腸道感染大鼠腸道細(xì)菌易位的影響來探索組胺對(duì)腸黏膜屏障是否有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 24月齡雄性 SD大鼠 30只,體重 260～270 g,購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng) 48 h,均未發(fā)現(xiàn)異常。組胺為 Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。大腸桿菌 O75購(gòu)于上海 Harmony公司。

1 .2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)前 24 h取大腸桿菌 O75單菌落放入 20ml肉湯培養(yǎng)液中培養(yǎng),24 h后離心 15 min(5 000 r/min)去上清,加生理鹽水 10 ml,再離心去上清,重復(fù) 3次后,再加生理鹽水 10ml,取其中 1ml菌液在分光光度計(jì)(波長(zhǎng) 600 nm)監(jiān)測(cè)下,加生理鹽水稀釋至吸光度為 0.4止,此時(shí)菌液的大腸桿菌濃度為 3×1011/L。組胺配制成 100 ng/ml濃度,遮光低溫保存?zhèn)溆?戊巴比妥鈉用蒸餾水配置成 1%濃度備用。

1.2.2 動(dòng)物模型制備 30只大鼠稱重、編號(hào)后,隨機(jī)分為對(duì)照組、腸道感染組和腸道感染+組胺組,每組 10只。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前 12h禁食,采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg),上腹部正中切口,在空腸上端插管接微泵。除對(duì)照組外,其他大鼠均從空腸上端灌注濃度 3×1011/L大腸桿菌液 0.4ml。菌液灌注后腸道感染 +組胺組大鼠立即用微泵向小腸內(nèi)灌注100ng/ml組胺,灌注速度第 1小時(shí) 2 ml,以后 1.5 ml/h,灌注4 h,對(duì)照組和腸道感染組用同樣方法向小腸內(nèi)灌注等量的生理鹽水,4 h后處死全部大鼠。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng) 在無菌條件下分別取出肝、腎和腸系膜淋巴結(jié),稱重后添加 10倍量生理鹽水研磨成勻漿,各取 0.2ml勻漿均勻涂于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上放入 37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng),24 h后計(jì)算菌落數(shù),并換算成每克組織含菌量(×105cfu/g)。每份標(biāo)本均做兩份培養(yǎng)。

2 結(jié) 果

對(duì)照組10只大鼠中,有 3只大鼠肝勻漿培養(yǎng)基有細(xì)菌生長(zhǎng)、2只大鼠腎勻漿培養(yǎng)基有細(xì)菌生長(zhǎng),1只大鼠腸系膜淋巴結(jié)勻漿培養(yǎng)基有細(xì)菌生長(zhǎng);腸道感染組全部大鼠肝、腎和腸系膜淋巴結(jié)勻漿培養(yǎng)基均有細(xì)菌生長(zhǎng);對(duì)照組與腸道感染組各組織間含菌量?jī)蓛杀容^,均呈顯著性差異(P＜0.01),表明腸道感染大鼠模型可靠。腸道感染 +組胺組 10只大鼠中,有 10只大鼠肝勻漿培養(yǎng)基有細(xì)菌生長(zhǎng)、7只大鼠腎勻漿培養(yǎng)基有細(xì)菌生長(zhǎng),5只大鼠腸系膜淋巴結(jié)勻漿培養(yǎng)基有細(xì)菌生長(zhǎng);與對(duì)照組和腸道感染組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,P＜0.05)。見表 1。

表1 各組大鼠各組織細(xì)菌培養(yǎng)平均含菌量(×105 cfu/g,±s)

表1 各組大鼠各組織細(xì)菌培養(yǎng)平均含菌量(×105 cfu/g,±s)

與腸道感染組比較:1)P＜0.01,2)P＜0.05

組別 n 肝 腎 腸系膜淋巴結(jié)正常對(duì)照組 10 1.02±0.431)0.62±0.301)0.38±0.251)腸道感染組 10 8.35±3.27 7.16±3.18 5.68±2.86腸道感染 +組胺組 10 5.25±2.082)4.06±2.022)3.58±1.862)

3 討 論

腸黏膜屏障是機(jī)體抵御外來病原微生物入侵的第一道防線。生理情況下,腸道通過腸黏膜上皮細(xì)胞及周圍緊密連接構(gòu)成的上皮屏障;黏膜表面的黏液及不移動(dòng)水層構(gòu)成的黏液屏障;正常微生物群構(gòu)成的生物屏障;腸黏膜免疫系統(tǒng)中各種免疫細(xì)胞以及它們所產(chǎn)生的免疫球蛋白、淋巴因子構(gòu)成的免疫屏障;腸腔內(nèi)胃酸、膽汁及各種消化酶、激素等構(gòu)成的化學(xué)屏障來維持腸黏膜屏障的功能完整,以有效地防止病原微生物及毒素通過腸黏膜侵入機(jī)體〔1〕。但是,在嚴(yán)重創(chuàng)傷、全身及腸道嚴(yán)重感染、缺血及缺血-再灌注、營(yíng)養(yǎng)障礙及全胃腸外營(yíng)養(yǎng)、腸道內(nèi)微生態(tài)失調(diào)、休克等情況下,可引起腸黏膜屏障損傷。腸道內(nèi)原籍菌或外來菌以及它們的毒素就可突破腸黏膜屏障引起細(xì)菌易位〔4〕。正常情況下,腸道細(xì)菌也可通過門靜脈到達(dá)肝、腸淋巴系統(tǒng)到腸系膜淋巴結(jié),但很少有腸道細(xì)菌通過血液循環(huán)到達(dá)腎。陳吉等〔5〕報(bào)道腸系膜淋巴結(jié)有 5%～10%的概率可以檢測(cè)到腸道細(xì)菌,這種自發(fā)性細(xì)菌易位,可能是機(jī)體全身免疫應(yīng)答反應(yīng)調(diào)節(jié)過程中的一種重要刺激源。楊書良等〔6〕報(bào)道 10月齡正常大鼠肝、腸系膜淋巴結(jié)組織中可見少量腸道細(xì)菌易位,腎組織中未發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)菌易位。本實(shí)驗(yàn)除發(fā)現(xiàn)老齡大鼠肝、腸系膜淋巴結(jié)組織中有少量腸道細(xì)菌易位外,腎組織中也發(fā)現(xiàn)了少量腸道細(xì)菌易位,這可能與老齡大鼠全身組織器官萎縮,腸黏膜各種屏障功能減弱有關(guān)。分泌型IgA(sIgA)是人類腸黏膜免疫屏障的主要抗體,它與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),特別和腸道感染、慢性鼻竇炎、呼吸道感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染等關(guān)系密切。sIgA在腸黏膜局部免疫中發(fā)揮著重要作用,它們占據(jù)著黏膜表面,阻止細(xì)菌在腸黏膜表面停留、黏著、形成菌落〔7〕;可以和抗原結(jié)合形成大分子的復(fù)合物,阻止其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);sIgA作為調(diào)理素與抗原結(jié)合,使細(xì)菌等微生物發(fā)生調(diào)理素化,增加黏膜表面單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的表面吞噬作用;sIgA還能在小腸內(nèi)結(jié)合和阻擋沒有經(jīng)過消化的大分子蛋白質(zhì)穿過腸黏膜,避免引起機(jī)體的變態(tài)反應(yīng)〔8〕。

組胺是一種作用廣泛的單胺類物質(zhì),是肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志物,在胃腸道的含量尤為豐富。它可通過其 H1R、H2R、H3R、H4R4種受體參與多種生理功能調(diào)節(jié),如胃腸分泌與蠕動(dòng)、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)等。小劑量的組胺進(jìn)入腸道后,可激活腸道中的肥大細(xì)胞使其脫顆粒釋放組胺,釋放的組胺又可激活鄰近的肥大細(xì)胞脫顆粒,形成自身放大機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)〔9〕。老齡大鼠各種組織和器官都會(huì)出現(xiàn)不同程度的萎縮、功能下降,特別是免疫系統(tǒng)的功能下降明顯。席豐等〔10〕研究證明,小劑量組胺腸道灌注后可增加老齡大鼠腸黏膜對(duì) sIgA的分泌,增強(qiáng)腸黏膜免疫屏障的保護(hù)作用。

大腸桿菌 O75進(jìn)入小腸后,可在腸黏膜表面大量生長(zhǎng)繁殖,導(dǎo)致腸黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死,腸黏膜屏障受損,腸道內(nèi)的細(xì)菌即可突破腸黏膜屏障進(jìn)入門靜脈、腸淋巴系統(tǒng)引起腸道細(xì)菌易位。本實(shí)驗(yàn)?zāi)c道感染組大鼠肝、腎、腸系膜淋巴結(jié)勻漿培養(yǎng)均有大量細(xì)菌生長(zhǎng),而腸道感染加組胺治療組肝、腎、腸系膜淋巴結(jié)勻漿培養(yǎng)細(xì)菌明顯減少,可能是因?yàn)榻M胺通過以下機(jī)制對(duì)腸黏膜屏障進(jìn)行保護(hù):①組胺具有擴(kuò)張細(xì)小動(dòng)脈改善腸道血液循環(huán);②促進(jìn)液體的滲出和白細(xì)胞的趨化作用,滲出液中的免疫球蛋白、補(bǔ)體、殺菌肽、溶菌酶、纖維素等,可中和毒素、殺滅細(xì)菌及增加白細(xì)胞的吞噬功能〔11〕;③促進(jìn)腸蠕動(dòng)、減少致病菌在腸道中停留的時(shí)間;④促進(jìn)胃酸、膽汁和各種消化酶的分泌,抑制致病菌的生長(zhǎng);⑤促進(jìn)黏液分泌維持腸道內(nèi)正常微生態(tài);⑥激活抗原提呈細(xì)胞,增強(qiáng)其提呈抗原、合成促炎細(xì)胞因子〔12〕參與細(xì)胞免疫和體液免疫〔13〕。

本研究提示,腸道感染時(shí)小劑量組胺腸內(nèi)灌注,有減輕老齡大鼠腸黏膜屏障損傷、保護(hù)腸黏膜屏障、阻止腸道細(xì)菌易位的作用。

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