劉永琦 吳曉晶 董介正 范 萍 孫少伯 顏春魯 (甘肅中醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)

腦缺血性梗死是一種高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的疾病,嚴(yán)重威脅人類健康。細(xì)胞凋亡是造成腦缺血再灌注后遲發(fā)性持續(xù)神經(jīng)細(xì)胞損傷不可忽視的重要因素〔1〕。因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有易于獲得、體外培養(yǎng)能快速擴(kuò)增、可自體移植并能夠轉(zhuǎn)染和長期表達(dá)外源性基因等特征,使其極具研究優(yōu)勢。近年來研究發(fā)現(xiàn),BMSCs能局部和靜脈注射移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷〔2～5〕。中醫(yī)藥在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療上具有顯著療效,補(bǔ)腎生髓法是臨床上治療腦血管疾病的常用治法。本文采用補(bǔ)益腎陽法、補(bǔ)益腎陰法、陰陽雙補(bǔ)法的代表方劑右歸丸、左歸丸、地黃飲子的動物含藥血清孵育BMSCs并移植到腦缺血大鼠體內(nèi),探討不同補(bǔ)腎法方藥孵育BMSCs對大鼠腦缺血再灌注模型腦組織細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物 Wistar大鼠,SPF級,8只,雌雄不限,體重(120±10)g,用于提取 BMSCs;40只,雌雄不限,體重(250±20)g,用于制備中藥血清;84只,雌雄各半,體重(300±30)g,用于實(shí)驗造模。以上動物皆由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供,實(shí)驗動物質(zhì)量合格證許可證編號:SCXK(甘)2004-0006-000001。

1.1.2 實(shí)驗藥物 左歸丸、右歸丸、地黃飲子均購于甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科,方藥組成及劑量均參照第7版方劑學(xué)教材。

1.1.3 主要試劑和儀器 L-DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司);0.25%胰酶(Sigma公司);全反式維甲酸(ATRA,Sigma公司);CD45、CD90熒光標(biāo)記抗體(Gibco公司);細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL)、兔抗大鼠 Caspase-3(武漢博士德生物工程有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱 (SANYO公司);超凈工作臺(蘇州凈化儀器廠);流式細(xì)胞儀(Beckman公司);熒光顯微鏡(Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 動物含藥血清的制備 水煎法分別制備右歸丸、地黃飲子、左歸丸藥液(1 g生藥/ml)。40只 Wistar大鼠依照隨機(jī)數(shù)字表分為空白組、右歸丸組、地黃飲子組、左歸丸組。晚禁食,空白組按 10 ml/kg的量予以生理鹽水灌胃,余各組按10 ml/kg量灌服相應(yīng)方藥煎劑,連續(xù) 3 d,2次/d;于第 3 d給藥后 2 h取血,分離血清,滅活、除菌、分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BMSCs的分離、純化 將大鼠脫臼處死,無菌條件下取出雙側(cè)股骨,除去骨表面附著組織,剪去兩端,用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡消毒 5～8 min,用含 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔,收集沖洗液,1 000 r/min,10 min離心,棄去上清液,重新加入含 10%胎牛血清的 DMEM,用尖吸管吹打均勻;調(diào)整細(xì)胞密度,以 1×106個/ml的密度將細(xì)胞懸液接種到容量 25cm2培養(yǎng)瓶中,于 37℃、體積分?jǐn)?shù)為 0.05的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng),每 3～4天換液 1次。待 BMSCs生長至 80%～90%融合時,用質(zhì)量濃度為 0.25%的胰酶消化傳代。

1.2.3 BMSCs的鑒定 獲得第 3代 BMSCs,加入熒光標(biāo)記CD90、CD45抗體,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面 CD90、CD45表達(dá)率。

1.2.4 BMSCs的孵育 將傳至第 3代的 BMSCs分別用內(nèi)含10%空白組的大鼠血清的 DMEM培養(yǎng)液、0.01 mg/L ATRA、10%FBS L-DMEM培養(yǎng)液、10%相應(yīng)含藥血清的 DMEM培養(yǎng)液于 37℃、氣體體積分?jǐn)?shù)為 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),飽和濕度條件下培養(yǎng)孵育。

1.2.5 局灶性腦缺血動物模型制備及實(shí)驗動物分組 采用Yuji等〔6〕所報道的線栓法建立 Wistar大鼠大腦中動脈缺血模型(MCAO)。參考Longa及Bederson評定神經(jīng)功能缺損程度,對造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、空白血清孵育 BMSCs移植組(簡稱 BMSCs組)、維甲酸孵育 BMSCs組(維甲酸組)、右歸丸血清孵育 BMSCs組(右歸丸組)、地黃飲子血清孵育 BMSCs組(地黃飲子組)、左歸丸血清孵育 BMSCs組(左歸丸組),另假手術(shù)組對照組。每組每個時間點(diǎn)各 6只。

1.2.6 BMSCs的移植 移植前對細(xì)胞進(jìn)行消化后離心,收集,用生理鹽水漂洗 3次,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),重懸,每 1ml生理鹽水的細(xì)胞個數(shù)為 1×106個/ml,假手術(shù)、模型組大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml,其余各組大鼠于造模 24h后經(jīng)尾靜脈輸入等量相應(yīng)中藥孵育后的 BMSCs。

1.2.7 取材與標(biāo)本處理 分別于移植后 7、14 d(每個時間點(diǎn)各 6只)用 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,手術(shù)充分暴露心臟,用4%的多聚甲醛溶液經(jīng)升主動脈進(jìn)行灌注固定,斷頭后剪開顱板取出全腦,以前囟為中心前后 1 mm(病變損害的中心),冠狀切取大鼠腦組織,置于 4%多聚甲醛固定液中,常規(guī)石蠟包埋,待做免疫組化測定。

1.2.8 TUNEL法檢測腦組織細(xì)胞凋亡的變化 將石蠟包埋標(biāo)本行冠狀切片,按試劑盒說明書進(jìn)行操作。陽性反應(yīng)細(xì)胞的胞質(zhì)為棕黃色;隨機(jī)選取缺血側(cè)皮層 5個視野;每組觀察 6張切片,合計 30個視野;計數(shù)陽性細(xì)胞,計算平均值。

1.2.9 Caspase-3表達(dá)的變化 采用免疫組織化學(xué)法,石蠟包埋標(biāo)本行冠狀切片,按試劑盒說明書進(jìn)行操作。陽性反應(yīng)細(xì)胞的胞質(zhì)為棕黃色;隨機(jī)選取缺血側(cè)皮層 5個視野;每組觀察 6張切片,合計 30個視野;計數(shù)陽性細(xì)胞,計算平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSSl 6.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示,多樣本均數(shù)比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的分離、鑒定及孵育 原代細(xì)胞培養(yǎng) 3d后觀察,即可見大量貼壁細(xì)胞,細(xì)胞完全舒展并呈現(xiàn)多種形態(tài),主要為長梭形、成纖維樣;4～5 d左右細(xì)胞數(shù)量明顯增加,集落漸擴(kuò)大,約8～9d基本鋪滿瓶壁形態(tài)為較均一長梭形。原代培養(yǎng)過程中可見部分懸浮造血細(xì)胞,經(jīng)數(shù)次換液后其基本消失。傳代細(xì)胞呈均勻分布,生長迅速,約3～4 d可鋪滿瓶壁,細(xì)胞多呈梭形。且傳至 3代的細(xì)胞形態(tài)單一均勻,融合后呈典型的極性,漩渦狀生長。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測,所培養(yǎng)的 3代BMSCs高表達(dá)BMSC表面標(biāo)志分子 CD90(97.1%),而極低表達(dá)造血細(xì)胞表面分子 CD45(0.1%),CD90+CD45-細(xì)胞為 97.1%,符合 2006年國際細(xì)胞治療協(xié)會(ISCT)給出的 BMSC的定義標(biāo)準(zhǔn)〔7〕。

2.2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的變化 假手術(shù)組有少量陽性表達(dá),模型組 7d、14 d缺血中心區(qū)和半暗帶區(qū)腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)較假手術(shù)組顯著增多(P＜0.01)。與模型組比較,各治療組7 d、14d腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)減少顯著(P＜0.05,P＜0.01)。地黃飲子組、左歸丸組 7 d、14 d腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)與 BMSCs、維甲酸、右歸丸組比較顯著減少 (P＜0.05,P＜0.01)。

2.3 各組大鼠腦組織 Caspase-3表達(dá)的變化 假手術(shù)組有少量 Caspase-3陽性表達(dá),模型 7 d、14 d組較假手術(shù)組明顯增多(P＜0.01)。與模型組比較,各移植組 7 d、14 d的 Caspase-3表達(dá)均有顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。地黃飲子組、左歸丸組 7 d、14 d腦組織的 Caspase-3表達(dá)與 BMSCs、維甲酸、右歸丸組比較顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。見表 2。

表1 各組大鼠腦組織TUNEL陽性細(xì)胞比較(個/HP,±s)

表1 各組大鼠腦組織TUNEL陽性細(xì)胞比較(個/HP,±s)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05,3)P＜0.01;與 BMSCs組比較:4)P＜0.05,5)P＜0.01;與維甲酸組比較:6)P＜0.05,7)P＜0.01;與右歸丸組比較:8)P＜0.05,9)P＜0.01;下表同

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表2 各組大鼠腦組織 Caspase-3表達(dá)變化比較(個/HP,±s)

表2 各組大鼠腦組織 Caspase-3表達(dá)變化比較(個/HP,±s)

分組 n 7 d 14 d假手術(shù)組 6 10.03±1.38 9.70±1.68模型組 6 26.13±4.401) 24.03±4.571)BMSCs組 6 24.10±4.662) 22.03±4.252)維甲酸組 6 22.07±4.563)4) 20.10±4.023)4)右歸丸組 6 23.73±4.132) 21.80±4.292)左歸丸組 6 19.53±3.913)5)6)9) 17.70±3.723)5)6)9)地黃飲子組 6 18.87±3.163)5)7)9) 16.77±3.073)5)7)9)

3 討 論

BMSCs易于體外分離、擴(kuò)增,具有良好的多向分化潛能等優(yōu)良特征而被認(rèn)為是可用于臨床細(xì)胞學(xué)治療的最佳干細(xì)胞之一〔8,9〕。腦缺血再灌注損傷后引起能量衰竭和酸中毒,產(chǎn)生大量的自由基、興奮性氨基酸對腦細(xì)胞產(chǎn)生損害,磷脂代謝的異常、積聚,同時促使離子自穩(wěn)機(jī)制破壞,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載,這些最終引起某些原癌基因的表達(dá),誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。腦缺血后,神經(jīng)元的死亡是一個極其復(fù)雜的病理過程,主要表現(xiàn)為壞死和凋亡兩種形式,在腦缺血急性期,神經(jīng)元壞死與凋亡并存,細(xì)胞壞死位于缺血中心區(qū),細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)在缺血半暗帶。而在腦缺血的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡期,則以細(xì)胞凋亡為主。Caspase家族可特異地在天門冬氨基酸殘基后裂解靶蛋白。Caspase-3是 Caspase級聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶。在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中 Caspase-3不僅可以促進(jìn)腦發(fā)育時期神經(jīng)元的凋亡,還可以促進(jìn)各種因素誘導(dǎo)培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡,Caspase-3可能是缺血神經(jīng)元凋亡的重要效應(yīng)分子〔10〕。本研究結(jié)果表明,BMSCs移植能減少腦缺血大鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù),抑制 Caspase-3的陽性表達(dá)。提示抑制腦組織細(xì)胞凋亡可能是BMSCs移植治療腦缺血損傷的作用機(jī)制之一。

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9 范 萍,劉永琦,吳曉晶,等.不同條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2010;26(4):322-4.

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