王春梅 李香艷 崔新穎 (北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

研究表明櫻桃富含多種維生素、花青素、各種花色苷、花色素、褪黑激素、多種酚類化合物等有效成分,具有調(diào)節(jié)睡眠、清除自由基、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌、保護(hù)心血管系統(tǒng)功能、降低血脂、改善糖尿病等作用〔1〕。而近年國外研究資料顯示酸櫻桃含有更為豐富的酚醛類物質(zhì)如花色苷等,其藥用價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甜櫻桃〔2〕,但國內(nèi)有關(guān)酸櫻桃的藥理學(xué)研究報(bào)道較少。本研究采用從加拿大 Alberta引進(jìn)的 Evans和 SK Carmine Jewel高產(chǎn)、優(yōu)良和抗逆性強(qiáng)的酸櫻桃新品種,自制酸櫻桃汁(PCLJ),利用 D-半乳糖衰老小鼠模型,通過行為學(xué)、功能學(xué)以及病理形態(tài)學(xué)等層面研究酸櫻桃汁的抗衰老作用,并初步探討其抗衰老作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 純系昆明種小鼠,雌雄各半,6周齡,體重(20±2)g,由長春高新區(qū)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號:SCXK 2(吉)200322004。各組小鼠同室分籠飼養(yǎng),顆粒飼料喂養(yǎng),自由飲水。

1.2 藥品及試劑 PCLJ由北華大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室自制;D-半乳糖購至國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:F20050711;維生素 E膠丸為昆明圣火制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn),批號:20051002。丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、脂褐素、膽堿酯酶(AChE)檢測試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.3 模型建立及給藥方法 昆明種小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 w后,將動(dòng)物隨機(jī)分為 6組:正常對照組、衰老模型組、維生素 E組、PCLJ低、中、高劑量組,每組 20只。模型組和給藥組小鼠每日接受頸背部皮下注射 D-半乳糖 120 mg/kg(生理鹽水配制),連續(xù) 8 w〔3,4〕,對照組注射等量的生理鹽水;同時(shí)給藥組小鼠每日分別灌胃相應(yīng)劑量的維生素 E(50 mg/kg)或 PCLJ(5,10,20 ml/kg),正常對照組和衰老模型組小鼠灌胃等量的生理鹽水,連續(xù) 8w。

1.4 學(xué)習(xí)記憶能力測試(小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)) 實(shí)驗(yàn)裝置為一長方形反射箱,大小為 32 cm ×22.5 cm ×33 cm,用黑色塑料板分隔成 6間。底面鋪以銅柵,間距為 0.5 cm,每間左角置一高度和直徑均為 4.5 cm的橡膠平臺(tái)。將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境 3 min,然后立即通以 32 V交流電,其正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)以躲避傷害性刺激。如此訓(xùn)練 5 min,24 h后重做測試,記錄動(dòng)物第 1次跳下平臺(tái)的潛伏期和 5 min之內(nèi)跳下平臺(tái)受到電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))〔5〕。

1.5 檢測指標(biāo) 學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,準(zhǔn)確稱量每只小鼠體重并記錄。斷頭處死后立即于冰臺(tái)上取出全腦、胸腺、脾組織,用預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖洗,用濾紙吸干,電子天平稱量全腦、脾和胸腺的重量。用于切片的腦組織置于10%甲醛中固定,其余臟器組織用錫箔紙包好,置-80℃超低溫冰箱保存待用。

1.5.1 各臟器指數(shù)的測定 準(zhǔn)確稱取小鼠全腦、胸腺、脾臟濕重后,計(jì)算各臟器指數(shù)(mg/g)〔胸腺重量(mg)/體重(g)〕。

1.5.2 腦組織中生化指標(biāo)的測定 將凍存的腦組織放入組織勻漿機(jī)配用的玻璃管中,加入 9倍體積預(yù)冷的生理鹽水(蒸餾水),充分研磨后,制成 10%腦組織勻漿。采用考馬斯亮藍(lán)法測定腦組織勻漿中總蛋白含量;硫代巴比妥酸反應(yīng)物法測定MDA含量;酶法檢測GSH-Px和AChE的活性;熒光法測定腦組織中脂褐素含量。具體檢測方法參照試劑盒說明書。

1.6 小鼠大腦組織病理形態(tài)學(xué)檢測 取 10%甲醛溶液固定的腦組織標(biāo)本,切取左、右大腦頂部及顳部皮質(zhì)組織(4 mm×4 mm×3 mm),將其置于 70%、80%的酒精中各漂洗 15 min,然后以 90%、100%酒精,100%酒精+丙酮,二甲苯依次脫水,透明,浸蠟,包埋,制成 4μm石蠟切片,行蘇木素-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié) 果

2.1 PCLJ對衰老小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響 在第 1天的學(xué)習(xí)測試中,模型組小鼠 5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)較正常對照組明顯增多,PCLJ中、高劑量組小鼠 5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)較模型組明顯減少(P＜0.01,P＜0.001)。在第 2天的記憶測試中,模型組小鼠第1次跳下平臺(tái)的潛伏期較正常對照組顯著縮短,5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P＜0.001),PCLJ低、中、高劑量組小鼠第 1次跳下平臺(tái)的潛伏期明顯延長,5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P＜0.05～0.001),并呈劑量依賴性。見表 1。

2.2 PCLJ對衰老小鼠臟器指數(shù)的影響 與正常對照組比較,模型組小鼠腦、胸腺、脾指數(shù)均顯著減小(P＜0.01～0.001)。PCLJ低、中、高劑量組小鼠腦、胸腺、脾指數(shù)明顯增大,并呈劑量依賴性。見表 2。

2.3 PCLJ對衰老小鼠腦組織 MDA、GSH-Px、AChE及脂褐素的影響 與正常對照組比較,模型組小鼠腦組織 MDA及脂褐素含量顯著提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01),而 AChE活性明顯升高。PCLJ中、高劑量組小鼠腦組織MDA及脂褐素含量顯著降低,GSH-Px活性明顯升高,AChE活性顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),并呈劑量依賴性。見表 2。

表1 PCLJ對衰老小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響(±s,n=20)

表1 PCLJ對衰老小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響(±s,n=20)

與正常對照組比較:1)P＜0.01,2)P＜0.001;與模型組比較:3)P＜0.05,4)P＜0.01,5)P＜0.001,下表同

組別 劑量(ml/kg)錯(cuò)誤次數(shù)(次) 記憶能力(5 min)潛伏期(s) 錯(cuò)誤次數(shù)(次)正常對照組 - 2.87±0.74 185.20±51.67 1.53±0.83衰老模型組 - 4.06±0.882)136.87±52.291) 2.87±0.922)PCLJ(低)組 5 3.33±0.82 179.00±57.373) 2.13±0.923)PCLJ(中)組 10 3.20±0.774)188.93±54.724) 1.93±0.804)PCLJ(高)組 20 2.93±0.705)207.67±57.995) 1.60±0.835)維生素 E組 50 mg/kg 3.53±0.743)176.80±55.593) 2.33±0.723)

表2 PCLJ對衰老小鼠臟器指數(shù)和腦組織中生化指標(biāo)的影響(±s,n=20)

表2 PCLJ對衰老小鼠臟器指數(shù)和腦組織中生化指標(biāo)的影響(±s,n=20)

組別 劑量(ml/kg)腦指數(shù)(mg/g)胸腺指數(shù)(mg/g)脾指數(shù)(mg/g)MDA(nmol/ml)GSH-Px(U)AChE(U/mgprot)脂褐素(μg/g)正常對照組 - 14.53±1.12 2.17±0.16 3.18±0.29 4.96±0.21 0.27±0.04 0.28±0.06 0.523±0.056衰老模型組 - 12.51±1.132) 1.77±0.272) 2.76±0.271) 5.46±0.261) 0.23±0.031) 0.36±0.071)0.638±0.0841)PCLJ(低)組 5 13.37±0.923) 1.89±0.19 2.97±0.183) 5.28±0.36 0.24±0.02 0.32±0.01 0.590±0.036 PCLJ(中)組 10 13.63±0.894) 2.01±0.323) 3.05±0.264) 5.18±0.272) 0.25±0.032) 0.30±0.022)0.576±0.0322)PCLJ(高)組 20 14.06±0.895) 2.12±0.204) 3.18±0.275) 4.98±0.393) 0.27±0.033) 0.29±0.023)0.548±0.0573)維生素 E組 50 mg/kg 13.28±0.783) 1.94±0.21 2.96±0.203) 5.35±0.225 0.25±0.032) 0.31±0.032)0.581±0.0512)

2.4 PCLJ對衰老小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)的影響 正常對照組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞豐富,排列整齊,著色正常;模型組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著減少,排列疏松,殘存神經(jīng)細(xì)胞固縮變圓,著色變淺;PCLJ低劑量組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)介于正常對照組和衰老模型組之間;PCLJ高劑量組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞略減少,部分神經(jīng)細(xì)胞胞體變小或者淡染。

圖1 PCLJ對衰老小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)的影響(HE,×100)

3 討 論

本研究采用 D-半乳糖小鼠皮下注射 8 w,造成亞急性衰老小鼠模型〔6〕,其一般狀態(tài)欠佳,跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著減退,而PCLJ治療組小鼠毛色光澤、精神狀態(tài)良好,學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。

組織器官的重量,特別是腦、胸腺、脾、肝、腎等重要器官的重量變化是反映生物體衰老程度的重要指標(biāo)〔7〕。免疫器官衰變最明顯的是胸腺和脾,胸腺和脾重量的降低、萎縮、功能衰退可使免疫功能降低,導(dǎo)致老年動(dòng)物(人)惡性疾病發(fā)生率增高,加速老化進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示 D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠腦、胸腺和脾臟指數(shù)均顯著下降,PCLJ治療明顯提高了衰老小鼠腦、胸腺及脾臟重量,說明PCLJ能夠有效對抗小鼠腦的衰老,保持機(jī)體的免疫功能,提高抗病能力,從而對延緩衰老具有積極的意義。

衰老機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一,其在腦組織中的水平隨著年齡的增加而升高,可反映自由基對機(jī)體的損傷程度〔8〕。脂褐素是 MDA與含有游離氨基酸的蛋白質(zhì)、磷脂酰乙醇胺及核酸等物質(zhì)進(jìn)一步作用形成的一種有自發(fā)熒光的復(fù)合物,終身存在于細(xì)胞內(nèi),又稱老年色素,其含量隨著老化增加,逐漸充盈細(xì)胞,甚至取代細(xì)胞核,是目前公認(rèn)的老化標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)表明 PCLJ可明顯降低 D-半乳糖致衰老小鼠腦組織 MDA含量,中、高劑量組可顯著降低腦組織脂褐素的含量,提示其可減輕脂質(zhì)過氧化損傷,而發(fā)揮抗衰老作用。

GSH-Px是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的一種重要的催化過氧化分解的酶,它特異性地催化 GSH對過氧化氫的還原反應(yīng),抑制煙酸胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)形成 OH-,削弱對脂質(zhì)過氧化作用的損傷,從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 PCLJ可顯著提高 D-半乳糖致衰老小鼠腦組織GSH-Px活性,提高體內(nèi)抗氧化酶活性,減輕自由基對生物大分子的傷害。研究表明中樞膽堿能神經(jīng)功能與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)〔9〕,乙酰膽堿(ACh)是經(jīng)典的膽堿能神經(jīng)遞質(zhì),以興奮作用為主,亦有抑制作用。ACh在調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶尤其是近期記憶方面具有重要作用,是促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)遞質(zhì)。而 AChE是水解 ACh的酶,AChE活性增高,間接說明膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能減退導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酸櫻桃汁中、高劑量組小鼠腦組織 AChE活性較模型組明顯降低,提示PCLJ對衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶有明顯的改善作用,可能與抑制腦內(nèi)AChE合成,減少 ACh水解,保護(hù)腦組織神經(jīng)有關(guān)。

此外,病理形態(tài)學(xué)研究結(jié)果亦顯示PCLJ能夠明顯改善D-半乳糖致衰老小鼠大腦皮質(zhì)切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

酸櫻桃果實(shí)具有清除自由基、抗氧化等作用,并能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于氧化應(yīng)激損傷,有很強(qiáng)的減慢神經(jīng)退行性改變的作用〔10,11〕,從而改善衰老的行為學(xué)變化,提高衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,延緩衰老的進(jìn)程。本研究為將酸櫻桃開發(fā)成為抗衰老功能性食品和藥品提供了理論依據(jù)。有關(guān)酸櫻桃抗衰老作用的分子機(jī)制及其主要有效成分仍需要進(jìn)一步研究和探討。

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