宋大勇 岳 武 尹立春 林述凱 王 雷 李建華

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外一科,吉林 吉林 132011)

聲動(dòng)力化學(xué)療法(sonodynamic therapy,SDT)是一種腫瘤治療的新方法,對體外大鼠 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明顯殺傷作用〔1〕,為觀察 SDT對大鼠腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)效應(yīng),本文以大鼠顱內(nèi)C6膠質(zhì)瘤為模型,觀察SDT處理后大鼠腦膠質(zhì)瘤的形態(tài)學(xué)、凋亡檢測及相關(guān)基因表達(dá)的變化,以完善SDT抗膠質(zhì)瘤理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)外科研究所)、Wistar大鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)、血卟啉單甲醚(HMME,北京英發(fā)康美技術(shù)開發(fā)有限公司)、胎牛血清(天津 TBD公司)、RPMI1640培養(yǎng)液 (美國 Hylone公司)、胰蛋白酶(美國 AMRESCO公司)、TUNEL凋亡檢測試劑盒(寶靈曼公司)、兔抗鼠 Cyt-C、Caspase-3免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、山羊抗兔 IgG免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物制品有限公司)、SABC試劑盒通用型(Zymed公司)、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物制品有限公司)。

1.2 儀器 單純照射天使多功能治療儀(天使科技控股有限公司)、大鼠腦立體定向儀(上海江灣Ⅱ型)、MIR機(jī)(日本東芝公司 1.5TVISRT型)、倒置相差顯微鏡(日本 Olymp單純照射公司 IX 70型)、CO2培養(yǎng)箱(上海 Herae單純照射公司 BB 5060型)、潔凈操作臺(tái)(上海力申科學(xué)儀器有限公司 Hfsate1200型)、離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠 80-2B型)。

1.3 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng) C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于含 10%胎牛血清的 RPMI1640完全培養(yǎng)液 25 ml培養(yǎng)瓶中,將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2和 95%空氣的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)實(shí)驗(yàn)。

1.4 大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型的制作 Wistar大鼠(雄性,體重250～350 g)96只。術(shù)前 12 h禁食、禁水,1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射麻醉后,固定于江灣Ⅱ型立體定向儀上,常規(guī)方法制作大鼠顱內(nèi) C6腦膠質(zhì)瘤模型〔2〕。術(shù)后連續(xù) 3 d注射青霉素 4萬U/d,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠接種C6膠質(zhì)瘤術(shù)后 14 d,經(jīng)MIR掃描,待腫瘤直徑達(dá) 3～5mm隨機(jī)分成 4組:SDT組(1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后,尾靜脈注射 HMME10 mg/kg,2 h后 1.0 mHz頻率、0.5 W/cm2光強(qiáng)度、120 s照射)、單純照射組、單用HMME組(尾靜脈注射 HMME10 mg/kg)和未處理的對照組,每組 24只。大鼠避光 7 d,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.6 原位凋亡檢測和Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)水平觀察4組大鼠處理后 24 h、3,7d分別隨機(jī)處死 8只,開顱取出腫瘤組織。標(biāo)本常規(guī)固定、包埋、切片。①TUNNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況,方法按照Roche公司原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,常規(guī)封片,顯微鏡下觀察。結(jié)果判定是以核陽性為判定標(biāo)準(zhǔn),并結(jié)合 HE染色 40倍顯微鏡下觀察,對 HE染色證實(shí)為壞死的細(xì)胞不計(jì)數(shù)。細(xì)胞核內(nèi)的棕褐色染色為陽性細(xì)胞,400倍顯微鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野,兩人雙盲計(jì)數(shù) 500個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù),取均值。排除有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和壞死灶的區(qū)域,因?yàn)檫@給單個(gè)凋亡細(xì)胞的鑒別帶來困難。計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率:凋亡細(xì)胞百分率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù) +陰性細(xì)胞數(shù))×100%。②標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色采用SABC法,按說明書進(jìn)行操作,常規(guī)封片,顯微鏡下觀察。Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果判定:每張切片 400倍顯微鏡觀察,隨機(jī)選擇 5個(gè)視野,兩人雙盲計(jì)數(shù) 500個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞胞漿內(nèi)棕褐色染色),取均值。計(jì)算蛋白表達(dá)百分率,蛋白表達(dá)百分率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù) +陰性細(xì)胞數(shù))×100%。對四組各時(shí)間點(diǎn)Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)率分別與凋亡率計(jì)算 Pearson相關(guān)系數(shù)(r值)。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀態(tài) 在實(shí)驗(yàn)過程中因操作不慎死亡或種瘤失敗的大鼠予以重新補(bǔ)充。大鼠接種后均無感染,從接種后第 3天開始,部分大鼠逐漸出現(xiàn)消瘦、肢活動(dòng)不靈活、抽搐、易激惹等表現(xiàn),瀕死前 4組均表現(xiàn)頻發(fā)抽搐、極度消瘦、惡病質(zhì)等癥狀。

2.2 組織學(xué)檢查結(jié)果 處理前膠質(zhì)瘤細(xì)胞均具有異形性特征,瘤組織內(nèi)有新生血管形成,腫瘤組織與腦組織無明顯分界。SDT組處理后 24 h腫瘤組織不規(guī)則片狀壞死,壞死區(qū)中心部分無細(xì)胞結(jié)構(gòu),碎裂、固縮的膠質(zhì)瘤細(xì)胞大量分布于壞死區(qū)向正常腫瘤組織過渡的交界區(qū);單純照射組處理后 24h腫瘤組織出現(xiàn)小片狀壞死區(qū),期間散在點(diǎn)狀壞死細(xì)胞,亦多分布于壞死區(qū)向正常腫瘤組織過渡的交界區(qū)(圖 1)。SDT組處理后 3 d腫瘤組織不規(guī)則片狀壞死區(qū)面積較24 h時(shí)明顯減小,壞死區(qū)內(nèi)仍可見較多碎裂、固縮膠質(zhì)瘤細(xì)胞;單純照射組處理后3d腫瘤組織內(nèi)偶見點(diǎn)狀壞死細(xì)胞。SDT組與單純照射組處理后 7 d時(shí)膠質(zhì)瘤組織形態(tài)同對照組及HMME組,未見壞死、碎裂的細(xì)胞。

圖1 SDT組和單純照射組HE染色處理后 24 h組織學(xué)結(jié)果(×40)

2.3 原位凋亡檢測結(jié)果 HMME組和對照組凋亡細(xì)胞極少,各時(shí)間點(diǎn)凋亡率比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表 1)。切片均未見明顯壞死細(xì)胞,偶見凋亡細(xì)胞。單純照射組處理后 24 h,切片可見小片狀壞死區(qū)和散在分布的壞死細(xì)胞,凋亡細(xì)胞散在分布,凋亡率明顯高于 HMME組和對照組(P＜0.01);處理后 3 d切片可見散在壞死細(xì)胞,偶見凋亡細(xì)胞,凋亡率較處理后24h下降,與 HMME組和對照組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;處理后 7 d,切片未見明顯壞死細(xì)胞,偶見凋亡細(xì)胞,凋亡率與 HMME組和對照組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SDT組處理后 24 h,切片可見明顯片狀壞死區(qū)或壞死細(xì)胞,凋亡細(xì)胞多分布于片狀壞死區(qū)周邊,或與壞死細(xì)胞夾雜,凋亡率明顯高于其他 3組(P＜0.01)(圖 2);處理后 3 d,切片見片狀壞死區(qū)明顯縮小、壞死細(xì)胞數(shù)量明顯減少,凋亡細(xì)胞少見,但凋亡率與其他 3組比較差異顯著(P＜0.01);處理后 7d,切片未見壞死細(xì)胞,凋亡細(xì)胞偶見,凋亡率與其他 3組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 單純照射組和SDT組原位凋亡檢測處理后 24 h(×400)

2.4 Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果 HMME組和對照組 Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞偶見,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)率各時(shí)間點(diǎn)比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。切片均未見明顯壞死細(xì)胞。單純照射組處理后24 h,切片可見小片狀壞死區(qū)和散在分布的壞死細(xì)胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞多分布于小片狀壞死區(qū)周邊,或與壞死細(xì)胞夾雜,表達(dá)率高于 HMME組和對照組(P＜0.01);處理后 3 d切片可見散在壞死細(xì)胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞偶見,多與壞死細(xì)胞夾雜或分布其周邊,但表達(dá)率較處理后 24h明顯下降,與 HMME組和對照組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;處理后 7 d,切片未見明顯壞死細(xì)胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞偶見,蛋白表達(dá)率與 HMME組和對照組近似,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SDT組處理后 24 h,切片可見明顯片狀壞死區(qū)或壞死細(xì)胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞多分布于片狀壞死區(qū)、壞死細(xì)胞周邊或夾雜其中,蛋白表達(dá)率明顯高于其他 3組(P＜0.01);處理后 3d,切片見片狀壞死區(qū)明顯縮小、壞死細(xì)胞數(shù)量明顯減少,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞多分布于片狀壞死區(qū)或壞死細(xì)胞周邊,數(shù)量也明顯減少,但 Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)率與其他 3組比較差異顯著(P＜0.01);處理后 7d,切片未見明顯壞死細(xì)胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞偶見,蛋白表達(dá)率與HMME組和對照組近似,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表 1和圖 3)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)凋亡率、Cyt-C和Caspase-3蛋白表達(dá)率的比較(±s,%,n=8)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)凋亡率、Cyt-C和Caspase-3蛋白表達(dá)率的比較(±s,%,n=8)

與 SDT組比較:1)P＜0.01;與對照組比較:2)P＜0.01

組別 凋亡率24 h 3 d 7 d Cyt-C蛋白24h 3 d 7 d Caspase-3蛋白24 h 3 d 7 d SDT組 25.10±0.822) 1.23±0.542) 0.23±0.23 36.18±1.382) 1.95±0.502) 0.08±0.10 30.18±1.102) 1.43±0.702) 0.05±0.09單純照射組 6.28±0.681)2) 0.35±0.401) 0.13±0.28 5.90±1.081)2) 0.18±0.231) 0.10±0.19 5.18±0.771)2) 0.08±0.101) 0.00±0.00 HMME組 0.30±0.301) 0.18±0.231) 0.28±0.51 0.20±0.261) 0.08±0.151) 0.03±0.07 0.05±0.091) 0.03±0.071) 0.05±0.14對照組 0.43±0.381) 0.38±0.361) 0.23±0.29 0.08±0.101) 0.10±0.111) 0.08±0.15 0.08±0.151) 0.10±0.111) 0.03±0.07

圖3 SDT組和單純照射組處理后 24 h Cyt-C和 Caspase-3蛋白表達(dá)(×400)

2.5 SDT組 Cyt-C和Caspase-3蛋白表達(dá)率與凋亡率的相關(guān)性分析 Cyt-C蛋白和 Caspase-3蛋白表達(dá)率與凋亡率呈正相關(guān)(均為 r=0.99,P＜0.01)。

3 討 論

研究表明,化療、放療、基因治療、光動(dòng)力療法(PDT)等均可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡過程,提高療效,延長患者的生存期。研究已經(jīng)證實(shí) SDT可引起體外 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡〔1〕,因此凋亡也是 SDT殺傷C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的方式之一。通過組織學(xué)及原位凋亡檢查,發(fā)現(xiàn)大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤SDT處理后早期(24h)腫瘤組織壞死及凋亡均達(dá)到高峰,隨后壞死及凋亡的瘤組織均逐漸減少,至處理后 7 d時(shí)腫瘤組織中已見不到壞死及凋亡的瘤細(xì)胞,這表明:①膠質(zhì)瘤組織壞死和凋亡時(shí)間變化規(guī)律基本吻合,也表明凋亡是 SDT殺傷膠質(zhì)瘤的重要方式;②SDT處理大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤,24 h達(dá)到作用高峰,提示SDT如應(yīng)用于臨床,使用的時(shí)間間隔為 24h左右;③凋亡高峰出現(xiàn)于處理后早期(24 h),但凋亡時(shí)間較體外(6 h)略后移,這可能因?yàn)閱渭冋丈渥饔糜隗w外細(xì)胞時(shí)衰減低,而作用于顱腦組織中衰減增強(qiáng),較低的聲強(qiáng)度啟動(dòng)細(xì)胞凋亡時(shí)間較長有關(guān);④24 h后細(xì)胞凋亡明顯減少,處理后 7d,4組凋亡率已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明 SDT僅處理后24 h內(nèi)對細(xì)胞凋亡存在明顯影響,而中遠(yuǎn)期則無影響。

單純照射處理后也可引起膠質(zhì)瘤壞死及凋亡,其高峰同樣發(fā)生在早期(24 h),但腫瘤壞死面積及凋亡率明顯較 SDT低,提示:①單用單純照射有較弱的抗膠質(zhì)瘤效應(yīng);②凋亡也是單純照射殺傷體內(nèi)膠質(zhì)瘤的方式之一。單用HMME未顯示出抗膠質(zhì)瘤效應(yīng),對細(xì)胞凋亡無影響。通過與單純照射組、HMME組及對照組比較,表明 SDT的殺傷膠質(zhì)瘤效應(yīng)并非簡單的單純照射+HMME效應(yīng),而是二者結(jié)合發(fā)生一系列聲化學(xué)反應(yīng),激活聲敏劑分子,通過增效聲動(dòng)力效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞。劉全宏等〔3〕提出SDT誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑有可能依賴于線粒體結(jié)構(gòu)損傷后釋放 Cyto-C等蛋白,激活 Caspase家族蛋白,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。其中caspase-3作為關(guān)鍵蛋白酶,是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必由之路〔4〕。本結(jié)果表明 SDT處理后早期出現(xiàn)細(xì)胞凋亡可能是損傷線粒體后,釋放Cyto-C,激活Caspase家族蛋白,經(jīng)過一系列細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),活化了關(guān)鍵蛋白酶caspase-3引起的。單純照射處理后早期(24 h)也出現(xiàn) Cyto-C、Caspase-3蛋白較強(qiáng)的表達(dá),說明單純照射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能也與線粒體結(jié)構(gòu)損傷后釋放 Cyto-C等蛋白,激活 Caspase-3有關(guān)。單用 HMME未出現(xiàn) Cyto-C、Caspase-3蛋白的表達(dá),同樣未啟動(dòng)凋亡。

綜上,SDT對大鼠腦膠質(zhì)瘤有明顯的抑制效應(yīng),早期可能通過損傷線粒體后,釋放 Cyto-C,激活 Caspase-3,直接啟動(dòng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞本身凋亡程序,誘導(dǎo)大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

1 宋大勇,岳 武,趙 釗,等.聲動(dòng)力化學(xué)療法對體外C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的研究〔J〕.中華神經(jīng)外科雜志,2007;23(2):107-10.

2 劉 斌,金必連,李 齡 .激光間質(zhì)內(nèi)熱療聯(lián)合順鉑治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國激光醫(yī)學(xué)雜志,2001;10(2):74-7.

3 劉全宏,王 攀,李 萌,等 .聲化學(xué)激活血卟啉誘導(dǎo)艾氏腹水腫瘤細(xì)胞凋亡〔J〕.動(dòng)物學(xué)報(bào),2003;49(7):620-8.

4 李小明,孫志賢 .細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶-Caspase-3〔J〕.國外醫(yī)學(xué)?分子生物學(xué)分冊,1999;21(1):6-9.〔2010-09-11收稿 2010-12-19修回〕