劉 琛 赫長勝 (山東大學藥學院,山東 濟南 25002)

南藥巴戟天(Morinda officinalis How)為我國傳統(tǒng)名貴中藥,具有抗抑郁、抗衰老、抗腫瘤以及增強免疫力等多種生物學活性〔1〕?，F(xiàn)代研究資料表明巴戟天富含豐富的營養(yǎng)成分〔2〕,例如 VC、糖分及膠質以及人體所需要的有機物質。藥理研究表明,巴戟天提取物巴戟天多糖有較顯著的免疫增強作用〔3〕。本研究的目的在于觀察巴戟天多糖對肝星狀細胞片細胞中單核細胞超化蛋白(MCP)-1、白介素(IL)-8蛋白表達的影響,闡述巴戟天多糖對細胞的免疫作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株來源 肝星狀細胞片細胞由北京肝病醫(yī)院中心提供。主要由SV 40轉染 prague dauley大鼠星狀細胞組成,其表型為活化的肝星狀細胞(HSC),表達較高水平的 I型膠原、TIMP-1等。進行細胞學常規(guī)復蘇、傳代之后,放于 5.0%CO2飽和條件下細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng),備用。

1.1.2 試劑及耗材 培養(yǎng)基 DMEM、胰酶(美國Gibco公司)。標準的胎牛血清(北京鼎國公司),其余試劑均為國產(chǎn)的分析純。 96孔細胞培養(yǎng)板(北京生物公司),SP染色劑、MCP-1、IL-8單克隆抗體(中山金橋公司)。

1.1.3 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱,多普勒顯微鏡等。

1.1.4 巴戟天多糖的提取〔4〕取巴戟天粗品,粉碎,將藥材烘干后,準確稱取 500g,加入與體重多 10倍量的水,浸泡 30 min后,沸水浴 60 min,取溶液過濾,濾液中加入 3倍體積的乙醇,靜置過夜,將乙醇濾出后收集沉淀,干燥后為巴戟天粗多糖。將粗多糖溶解于適量的蒸餾水中,采用Sevag方法將蛋白去除(重復操作 3次),加入乙醇使得濃度為 80.0%,靜置過夜后,將沉淀收集。無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌,干燥。將沉淀物溶于蒸餾水,加入乙醇至溶液濃度為 70.0%,靜置過夜,濾過,用 70.0%乙醇反復淋洗,沉淀干燥,即得到巴戟天多糖純品。

1.2 方法

1.2.1 藥物血清的制備 青島大學實驗動物中心藥理所提供純種的雄性 Begile犬,將巴戟天多糖純品溶解后灌胃給藥,劑量為 2.0 ml/kg(相當于成人用量的 10倍)。給藥 2.5 h后,真空抗凝管抽取血液,離心,3 000r/min,離心3.0min,取上清液,加入巴戟天多糖,同時制備為血清,滅活后放于-20℃冰箱中冷凍備用。

1.2.2 培養(yǎng)基制備 基本培養(yǎng)基的配制:DMEM培養(yǎng)基采用三蒸水溶解,加入 3.0 g/L的 NaHCO3,2.5 g/L的 Hepes(經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌),5℃保存。完全培養(yǎng)基的配制:90.0%的基本培養(yǎng)基,10.0%的標準胎牛血清,鏈霉素10萬 U/L。含藥培養(yǎng)基的配制:將采集的藥物血清與含有5.0%標準胎牛的基本培養(yǎng)基配制成 2.5%濃度的藥物血清。

1.2.3 肝星狀細胞片細胞的培養(yǎng) 細胞以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37.5℃、5.0%CO2的培養(yǎng)箱中。當細胞生長密度為1.0×105～ 1.0×106后,按照 1∶3進行傳代。

1.2.4 給藥方式 取對數(shù)生長期的肝星狀細胞片細胞,用0.1%胰酶和 EDTA的混合液進行消化,用完全培養(yǎng)基將肝星狀細胞片細胞懸液調至 2.0×104/ml,接種于 96孔板中,每孔200μl。培養(yǎng) 24 h后加入乙醛達到終末濃度,造離體模型并更換含藥的培養(yǎng)基,持續(xù)培養(yǎng) 72 h,同時每板有 3個孔常規(guī)培養(yǎng)的肝星狀細胞片細胞作為空白對照組。72 h后,采用 5.0%多聚甲醛固定,干燥后備用。

1.3 細胞免疫組化 經(jīng)冷 PBS漂洗后,120 g/L甲醇固定,再經(jīng) PBST漂洗,1.0%Triton-X 100修復,暴露抗原,冷 PBST沖洗,3.0%甲醇-過氧化氫封閉內源性過氧化物酶,蒸餾水漂洗,100ml/L山羊血清封閉非特異性結合位點,棄去血清后,分別滴加 MCP-1、IL-8單克隆抗體,5.0℃靜置過夜,同時采用正常血清代替 I抗作為陰性對照。3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色15～20 min,乙醇逐級脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。最后置于顯微鏡下觀察,照像并分析圖像,每片截取 5個視野分析陽性信號的面密度,取平均值分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件,組間比較采用獨立樣本的 t檢驗,多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析或 χ2檢驗。

2 結 果

模型組肝星狀細胞片細胞中MCP-1、IL-8蛋白表達較正常組減少(P＜0.05),經(jīng)藥物血清培養(yǎng)后的肝星狀細胞片細胞中MCP-1及 IL-8的表達均較模型組增強(P＜0.05)。見表 1。

表1 巴戟天多糖對 MCP-1、IL-8蛋白表達的影響(±s)

表1 巴戟天多糖對 MCP-1、IL-8蛋白表達的影響(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 MCP-1 IL-8正常組 面積度(×10-3) 3.64±1.12 1.25±0.56吸光度(A) 0.154 6±0.001 2 0.112 5±0.000 5模型組 面積度(×10-3) 22.64±6.981) 13.25±7.341)吸光度(A) 0.107 8±0.002 31) 0.098 7±0.000 91)藥物血清組 面積度(×10-3) 13.12±1.471)2) 6.53±1.141)2)吸光度(A) 0.257 4±0.003 11)2)0.210 4±0.002 11)2)

3 討 論

近年來,隨著人們對于多糖生物學功能的深入認識,各種天然產(chǎn)物中提取的生物活性多糖的研究又一次成為人們關注的重中之重,目前已經(jīng)有 300多種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中被分離提取出來,其中在植物中,尤其是從中藥中提取的水溶性多糖最為重要〔5〕。巴戟天即為其中最重要的一種中藥材。現(xiàn)代研究也表明巴戟天中的營養(yǎng)成分較豐富,糖類物質的總量已經(jīng)達到了 49.79% ～58.25%〔6〕。

HSC活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心事件,同時淋巴細胞作為肝纖維化局部微環(huán)境中的一個主要的浸潤細胞,對纖維化進程具有重要的免疫調控作用。具體表現(xiàn)在,活化的 HSC可以促進淋巴細胞的浸潤及其在組織局部的存活;另外,淋巴細胞可以通過細胞間直接接觸或旁分泌兩種方式影響HSC的促纖維化功能。HSC主要通過旁分泌,即HSC可以分泌MCP-1、IL-8、巨噬細胞炎性蛋白-1α等多種趨化因子〔7〕,其中 MCP-1幾乎全部是由 HSC合成,具有較強的趨化單核細胞的能力,是慢性炎癥時重要的趨化信號〔8〕。

因此,本實驗選取與淋巴細胞免疫功能密切相關的 MCP-1、IL-8蛋白〔9〕進行研究,探討巴戟天多糖對星狀細胞促進免疫的作用機制。巴戟天多糖刺激 HSC增殖與藥物的濃度有一定的關系,在體內巴戟天多糖可以通過刺激 HSC的不斷增殖而促進對淋巴細胞的作用,增進免疫系統(tǒng)的功能〔10〕。本實驗研究發(fā)現(xiàn),乙醛刺激可以使HSC激活增殖,經(jīng)巴戟天多糖的藥物血清培養(yǎng)后,MCP-1、IL-8基因蛋白表達明顯增強。

綜上所述,巴戟天多糖在一定程度上可以促使 HSC增殖,其給藥血清中肝星狀細胞片細胞中的 MCP-1、IL-8表達較模型組細胞顯著增多,巴戟天多糖可能通過影響 MCP-1、IL-2等基因的表達,對免疫功能起到一定的調節(jié)作用。

1 姚 輝,趙 晟.名貴南藥巴戟天〔J〕.植物雜志,2002;3(1):26-7.

2 周法興.巴戟天化學成分的研究〔J〕.中藥通報,1986;11(9):43.

3 黃彩玲,林 勇,肖柳英,等.巴戟天對 S-180荷瘤小鼠的免疫增強作用〔J〕.中藥材,2009;32(11):1738-41.

4 郭素華,王和鳴,黃 濤,等.南靖巴戟天多糖的含量測定〔J〕.福建中醫(yī)學院學報,2006;16(1):32-3.

5 張惟杰.糖復合物生化研究技術〔M〕.第 2版 .杭州:浙江大學出版社,2003:120-6.

6 林 勵,徐鴻華,王素英,等 .不同年齡巴戟天微量元素、氨基酸及糖含量測定〔J〕.廣州中醫(yī)學院學報,1992;9(3):160-3.

7 Holt AP,Salmon M,Buckley CD,et al.Immune interactions in hepatic fibrosis.or“Leucocyte-stromal interactions in hepatic fibrosis” 〔J〕.Clin Liver Dis,2008;12:861-82.

8 陳彩英,詹若挺,陳蔚文.巴戟天的藥理研究進展〔J〕.中藥新藥與臨床藥理,2009;20(3):291-4.

9 李 婧,蔣 煒.肝星狀細胞與肝臟局部免疫調控〔J〕.國際消化病雜志,2010;30(2):68-70.

10 陳小娟,李愛華,陳再智.巴戟天多糖免疫藥理研究〔J〕.實用醫(yī)學雜志,2000;11(5):348-9.