陳建珍 葉 蓓 (蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系,江蘇 蘇州 215009)

缺血再灌注性腦損傷所致神經(jīng)元的壞死與凋亡是腦缺血導(dǎo)致細(xì)胞損傷的主要標(biāo)志,同時(shí)還是反映治療效果的重要指標(biāo)〔1〕。細(xì)胞凋亡的通路中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)是凋亡的啟動者和執(zhí)行者,其活性增加導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡〔2〕。國內(nèi)研究報(bào)道丹參對缺血缺氧性腦損傷具有防治作用〔3〕。但丹參針對神經(jīng)細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的機(jī)制及保護(hù)區(qū)域報(bào)道較少。海馬對缺血具有較高的敏感性和高度的選擇性〔4〕。本實(shí)驗(yàn)旨在探討丹參對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑和儀器 正常健康 SD大鼠50只,體質(zhì)量250～300 g,雌雄不限。復(fù)方丹參注射液為麗珠集團(tuán)利民制藥廠提供,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字 263024779;Hoechst33258熒光染色試劑盒由南京建成有限公司提供;caspase-3多克隆抗體,鏈霉親合素-生物素-過氧化物復(fù)合物法(SABC)免疫組化染色試劑盒,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒,均由武漢博士德生物工程有限公司提供。Leica恒冷箱切片機(jī)(德國),Olympus熒光顯微鏡(日本),捷達(dá)形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為 3組:(1)假手術(shù)組(對照組)(n=8);(2)腦缺血再灌注組(n=21);(3)復(fù)方丹參組(n=21);除第 1組外其余兩組分為術(shù)后 12、24、48h 3個(gè)時(shí)點(diǎn),每個(gè)時(shí)點(diǎn) 7只大鼠。大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型的制備采用大腦中動脈內(nèi)線栓阻斷法(middle cerebral artery occlusion,MCAO),阻斷血流1 h后,拔線實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組動物除不插線外,其他操作同模型制備步驟。復(fù)方丹參組在手術(shù)前(缺血再灌注造模前)30 min,腹腔注射復(fù)方丹參注射液,劑量為 5 g/kg。動物模型制作成功標(biāo)準(zhǔn):動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈后,各只大鼠均發(fā)生呼吸急促,心跳加快。大鼠清醒后,出現(xiàn)追尾癥,運(yùn)動時(shí)軀體向左側(cè)旋轉(zhuǎn)。

1.2.2 取材和切片 各組大鼠按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)斷頭處死,開顱取腦,選取含海馬、齒狀回的腦組織用冷凍包理劑(OCT)包埋后入液氮速凍,應(yīng)用恒冷箱切片機(jī)連續(xù)冠狀切片。

1.2.3 Hoechst 33258熒光染色 切片采用 4℃冷丙酮固定5 min,經(jīng)蒸餾水稍洗后,滴加 Hoechst 33258染色液染色 5 min。然后經(jīng)蒸餾水洗片,去除多余液體。在熒光顯微鏡下,以 U激發(fā)為激發(fā)條件,在 200倍視野中進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.4 caspase-3免疫組化染色 免疫組化按試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行,切片經(jīng)新鮮二甲苯脫蠟,3%過氧化氫孵育10 min,0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡 5 min,滴加 1∶100 caspase-3多克隆抗體,余步驟同試劑盒說明書,以已知陽性切片作為陽性對照,PBS液置換一抗作為陰性對照。每批切片分別制作 1張陽性對照和 1張陰性對照切片。

1.2.5 體視學(xué)分析 每只動物隨機(jī)分別選取 5張 Hoechst 33258熒光染色和 caspase-3免疫組化染色切片,分別于左、右兩側(cè)海馬 CA 1、CA 2、CA3、CA 4區(qū)、齒狀回隨機(jī)選取多個(gè)視野,在 200倍鏡中觀察拍照。用高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)分別測量參照系(海馬區(qū)細(xì)胞比較集中在錐體層和多行層,齒狀細(xì)胞比較集中在回顆粒層和多行層)總截面積(Ar),凋亡細(xì)胞的總截面積(Ax),根據(jù)體視學(xué)公式:體密度(Vv)=Ax/Ar,測算出凋亡細(xì)胞的 Vv。平均體積(V)測算:用圖像分析系統(tǒng)測量凋亡細(xì)胞的平均直徑(D),根據(jù)體視學(xué)公式:V=(4π/3)?(D/2)3,測算細(xì)胞的V。根據(jù)體視學(xué)公式:數(shù)密度(Nv)=Vv/V,測算細(xì)胞的 Nv。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,對單因素計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Hoechst 33258熒光染色結(jié)果 熒光染色顯微鏡下可見凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)明亮鮮艷的藍(lán)色熒光,正常細(xì)胞核為暗藍(lán)色,顏色較深。對照組中海馬區(qū)和齒狀回區(qū)中可見極少量明亮的藍(lán)色熒光的凋亡細(xì)胞;缺血再灌注組海馬CA1、CA 2區(qū)大量分布明亮的藍(lán)色熒光的凋亡細(xì)胞,部分凋亡細(xì)胞核聚縮,呈不規(guī)則形態(tài),其他部位相對較少;在丹參組海馬區(qū)和齒狀回區(qū)仍可見發(fā)出明亮熒光的凋亡細(xì)胞,但數(shù)量較模型組明顯減少。見圖1。

2.2 caspase-3免疫組化結(jié)果 鏡下可見凋亡細(xì)胞胞質(zhì)、胞核呈棕黃色細(xì)顆粒狀。對照組中海馬區(qū)和齒狀回區(qū)中偶見陽性表達(dá)的凋亡細(xì)胞;缺血再灌注組中海馬CA1、CA2區(qū)可以清晰看見陽性表達(dá)的凋亡細(xì)胞多在錐體層,齒狀回未見表達(dá);在丹參保護(hù)組海馬區(qū)和齒狀回區(qū)仍可見陽性表達(dá)的凋亡細(xì)胞,但數(shù)量較模型組明顯減少。見圖 2。

圖1 各組熒光染色結(jié)果(×200)

圖2 各組 caspase-3免疫組化結(jié)果(×200)

2.3 體視學(xué)分析結(jié)果 各組大腦各部位平均Hoechst 33258熒光染色顯示的凋亡細(xì)胞及平均caspase-3陽性表達(dá)細(xì)胞的Vv和 Nv結(jié)果。見表 1,表 2。

表1 各組平均Hoeehst33258熒光染色凋亡細(xì)胞 Vv(×10-2μm3/μm3,±s)

表1 各組平均Hoeehst33258熒光染色凋亡細(xì)胞 Vv(×10-2μm3/μm3,±s)

與模型組比較:1)P＜0.05,下表同

組別 CA1 CA2 CA 3 CA4 齒狀回區(qū)對照組 0.89±0.23 0.74±0.36 0.68±0.14 0.74±0.23 0.95±0.32缺血再灌注組 7.31±1.24 6.74±1.14 3.21±0.70 3.40±1.05 2.15±0.61復(fù)方丹參組 4.36±1.181)3.27±0.631)2.65±0.86 2.27±0.79 1.36±0.60

表2 各組平均 caspase-3陽性表達(dá)的凋亡細(xì)胞 Nv(×10-2μm3/μm3,±s)

表2 各組平均 caspase-3陽性表達(dá)的凋亡細(xì)胞 Nv(×10-2μm3/μm3,±s)

組別 CA1 CA2 CA 3 CA4 齒狀回區(qū)對照組 1.45±0.24 1.48±0.19 1.46±0.25 1.62±0.30 1.15±0.31缺血再灌注組 6.21±0.51 7.33±1.60 3.51±0.98 3.49±0.88 2.87±1.24復(fù)方丹參組 3.27±0.691)3.96±0.221)2.41±0.78 2.73±0.71 2.24±0.33

3 討 論

細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的、由caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程〔5〕。caspase-3作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白水解酶,它的激活是凋亡過程中的核心環(huán)節(jié),并且是所有凋亡途徑的最后效應(yīng)因子,它能夠激活脫氧核糖核酸酶,裂解DNA成碎片,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔6〕。 Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料,對細(xì)胞毒性較低,染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀測定,常用于細(xì)胞凋亡的檢測。因此本研究采用 Hoechst 33258熒光染色和免疫組化方法檢測caspase-3,觀察海馬、齒狀回細(xì)胞凋亡情況。大鼠腦缺血發(fā)生時(shí),缺血缺氧激活了細(xì)胞凋亡基因的表達(dá),再灌注后大量氧自由基對細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷的同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,同時(shí)鈣超載激活一系列鈣依賴性酶促反應(yīng),促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔7〕。海馬 CA1、CA2區(qū)作為腦缺血再灌注的損傷區(qū)域,腦缺血再灌注后導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子增多,激活鈣依賴性酶促反應(yīng),將 DNA破壞形成細(xì)胞凋亡的特征〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)腦缺血再灌注后凋亡神經(jīng)細(xì)胞主要分布于缺血側(cè)海馬 CA1、CA2區(qū),而腦組織其他區(qū)域凋亡細(xì)胞明顯較少,其原因可能是海馬是腦缺血敏感的部位,其中海馬CA1、CA2區(qū)細(xì)胞對缺血特別敏感,短暫性腦缺血發(fā)作后CA1、CA 2區(qū)的細(xì)胞發(fā)生選擇性遲發(fā)性死亡,而齒狀回、其他區(qū)域的細(xì)胞對缺血相對抵抗〔9〕;海馬缺血區(qū)域和齒狀回神經(jīng)細(xì)胞caspase-3的活性在缺血再灌注后逐漸降低,可能是神經(jīng)細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制發(fā)揮作用,caspase-3活性的降低限制和減少了腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展過程〔10〕。目前許多實(shí)驗(yàn)研究表明丹參具有改善缺血再灌注損傷腦神經(jīng)功能缺損、改善微循環(huán)、降低腦血管通透性、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、阻止鈣超載、清除氧自由基〔11〕、抗脂質(zhì)過氧化等作用〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在丹參注射液保護(hù)組,大鼠缺血側(cè)海馬 CA1、CA2區(qū)和齒狀回凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯減少,神經(jīng)細(xì)胞caspase-3活性顯著降低,說明丹參注射液對腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞 caspase-3的激活有抑制作用。丹參注射液通過抑制 caspase-3的激活,阻斷神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路,同時(shí)減少氧自由基的形成,降低腦缺血再灌注后腦細(xì)胞的凋亡數(shù)量,保護(hù)受損腦細(xì)胞,這可能是丹參注射液對抗腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。

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