李 軍 楊慧玲 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,河南 鄭州 450052)

天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是從葫蘆科植物栝樓的塊根中提取的一種蛋白質(zhì),為我國傳統(tǒng)中藥“天花粉”的有效成分,具有引產(chǎn)、抗腫瘤和抗免疫缺陷病毒(HIV)等多種生物學(xué)功能〔1,2〕。TCS屬于單鏈核糖體失活蛋白(ribosomeinactivatingprotein,RIP),以往的研究主要集中在其引起細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)方面。本文觀察 TCS對宮頸癌 Hela細(xì)胞增殖的抑制作用,從細(xì)胞自噬的角度探討TCS的抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞購自武漢大學(xué)典藏中心,用含 10%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司),在 5%CO2、37℃條件下培養(yǎng),每 3d傳代 1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。TCS為江蘇天晴制藥總廠產(chǎn)品,Beclin1和微管相關(guān)蛋白輕鏈 3(LC3)抗體購自美國 Santa Cruz公司,異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的IgG購自武漢凌飛公司,膽囊收縮素(cell counting kit,CCK-8)試劑盒由日本 Dojindo Laboratories生產(chǎn);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測 TCS對 Hela細(xì)胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期 Hela細(xì)胞接種于 96孔板上(細(xì)胞數(shù)為每孔 1×105個),待細(xì)胞貼壁分別加入不同濃度的TCS,每個濃度設(shè) 6個復(fù)孔,對照組加入相同體積的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h,每孔加入 10μl CCK-8試劑,于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育 1h,使用酶標(biāo)儀檢測 450 nm波長處吸光度值(A),以空白對照孔調(diào)零,按下列公式計算細(xì)胞生長抑制率:細(xì)胞生長抑制率 =(A對照組-A實驗組)/A對照組。

1.2.2 單丹磺酰尸胺(MDC)熒光染色檢測細(xì)胞自噬變化選擇抑瘤效果明顯的藥物濃度 80μg/ml分別給藥 3、6、12、24 h,使用含 MDC(0.05mmol/L)的新鮮培養(yǎng)基孵育 15 min,離心洗滌 2次后涂片,使用熒光顯微鏡加 356 nm發(fā)射濾片和545nm斷濾片進(jìn)行觀察、攝片。

1.2.3 Western印跡檢測細(xì)胞 Beclin1和LC3的表達(dá) 對數(shù)生長期 Hela細(xì)胞接種于 6孔板上,待細(xì)胞貼壁后加入 80μg/ml TCS,同時設(shè)立陰性對照,培養(yǎng)不同時間(0～24 h),用蛋白裂解液提取胞漿蛋白,考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。制備十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠,每孔上樣量 100μg,常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,37℃封閉 1 h,加入 Beclin1(1∶1 000)和 LC3抗體(1∶500)4℃孵育過夜,堿性磷酸酶標(biāo)記二抗(1∶3 000),室溫孵育 2 h,堿性磷酸酶染色 5 min,暗室內(nèi) X光膠片曝光顯影。圖像應(yīng)用 TotalLab2.0軟件進(jìn)行灰度分析并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 TCS對 Hela細(xì)胞的生長抑制作用 結(jié)果顯示TCS能夠顯著抑制 Hela細(xì)胞的生長,且此作用呈現(xiàn)明顯的時間和劑量依賴性。見表 1。

表1 TCS對Hela細(xì)胞生長的抑制率(%)

2.2 細(xì)胞自噬的形態(tài)學(xué)改變 TCS(80μg/ml)作用 3 h后,可見綠色點狀熒光顆粒散布于細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),這一效果一直持續(xù)到 24h后,且在給藥 6 h后自噬囊泡的數(shù)量最多,對照組則無此現(xiàn)象。

2.3 Beclin1和 LC3蛋白的表達(dá) 在 TCS分別作用于 Hela細(xì)胞 0、3、6、12、24 h后自噬特異性蛋白 Beclin1的相對灰度值為0.29±0.03、1.21 ±0.15、2.11±0.24、0.97 ±0.17、0.65 ±0.04;LC3相對灰度值為 0.35±0.02、1.28±0.11、2.18±0.21、1.05±0.19、0.61±0.06。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

自噬是一種從酵母到人類都存在的、高度保守的細(xì)胞行為,真核細(xì)胞借此來維持細(xì)胞生物合成和分解代謝之間的動態(tài)平衡,這一過程在清除細(xì)胞內(nèi)衰老的蛋白、細(xì)胞器及細(xì)胞器的構(gòu)建中起到重要作用,并與多種疾病和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔3〕。TCS的抗腫瘤作用機制主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成及促進(jìn)自然殺傷(NK)細(xì)胞的活性等方面〔4〕,通過觀察自噬是否參與了 TCS對 Hela細(xì)胞的生長抑制作用,可更好地闡明TCS的抗腫瘤作用機制。

本實驗中使用 TCS處理人宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞,CCK-8結(jié)果顯示TCS可顯著抑制 Hela細(xì)胞的增殖,且此作用呈現(xiàn)明顯的時間和劑量依賴性;MDC熒光染色結(jié)果顯示 TCS給藥后3 h可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生自噬,這一效果一直持續(xù)到 24 h后。Beclin1是酵母 ATG6基因在哺乳動物中的同源類似物,位于人類染色體 17q 21上,是自噬信號通路上第一個被確認(rèn)的腫瘤抑制分子〔5〕;LC3是酵母 ATG8在哺乳動物中的同源類似物,其脂質(zhì)修飾形式位于自噬泡膜的表面,現(xiàn)已作為自噬的特異性標(biāo)記蛋白〔6〕。Western印跡結(jié)果顯示,TCS作用 Hela細(xì)胞 3 h后自噬特異性蛋白 Beclin1和 LC3水平顯著升高,這一水平一直持續(xù)到 24 h后。這一結(jié)果說明,TCS能夠誘導(dǎo) Hela細(xì)胞自噬水平的提高,且自噬活化與 Beclin1和 LC3蛋白的激活有關(guān)。在以后的研究中需要對自噬在這一過程的作用進(jìn)行進(jìn)一步的研究,以便為可能開發(fā)以自噬為基礎(chǔ)的宮頸癌治療藥物提供新的方向。

1 Shaw PC,Chan WL,Yeung HW,et al.Minireview:trichosanthin-a protein with multiple pharmacological properties〔J〕.Life Sci,1994;55(4):253-62.

2 Shaw PC,Lee KM,Wong KB.Recent advances in trichosanthin,a ribosome-inactivating protein with multiple pharmacological properties〔J〕.Toxicon,2005;45(6):683-9.

3 Levine B,Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease〔J〕.Cell,2008;132(1):27-42.

4 張 茹,黃利鳴,岑暢飛.天花粉蛋白作用機制研究進(jìn)展〔J〕.時珍國醫(yī)國藥,2009;20(12):3116-7.

5 Yue Z,Jin S,Yang C,et al.Beclin 1,an autophagy gene essential for early embryonic development,is a haploinsufficient tumor suppressor〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2003;100(25):15077-82.

6 Galluzzi L,Aaronson SA,Abrams J,et al.Guidelinesfor the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes〔J〕.Cell Death Differ,2009;16(8):1093-107.