邢少姬 張利芳 韓麗紅 程子英

(包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院臨床生物化學(xué)與檢驗教研室,內(nèi)蒙古 包頭 014060)

維生素 D受體(VDR)被認為是遺傳調(diào)控骨和鈣代謝的主要候選基因之一。1994年 Morrison等〔1〕首先報道 VDR基因 3,端 Bsm1多態(tài)性與骨密度(BMD)相關(guān)以及可以預(yù)測 BMD。以后有研究〔2～6〕發(fā)現(xiàn)在 VDR基因的 5′端第二個外顯子中,存在Fok1內(nèi)切酶的多態(tài)性酶切位點,由于該位點是至今發(fā)現(xiàn)的唯一影響 VDR氨基酸結(jié)構(gòu)的多態(tài)性位點并與 BMD相關(guān)而備受關(guān)注。BMD是目前診斷OP的一個金標(biāo)準,它受營養(yǎng)、運動、遺傳及激素水平等多種因素,其中遺傳是影響B(tài)MD的主要因素。本文就內(nèi)蒙古地區(qū)老年女性VDR基因Fok1多態(tài)性與 OP的關(guān)系進行臨床觀察分析,為內(nèi)蒙古地區(qū)OP的研究提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 102名老年(年齡 ＞60歲)女性,分為兩組:①OP組:患者(以同部位正常年輕女性平均 BMD峰值減低兩個標(biāo)準差為 OP診斷標(biāo)準)32例,平均年齡(72.5±6.4)歲。均無高血壓、腎病、糖尿病等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病病史,無使用糖皮質(zhì)激素史。②對照組:健康體檢人員 70例,平均年齡(70.5±5.2)歲。均無高血壓、腎病、糖尿病等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病病史,并且均未應(yīng)用過影響骨代謝的藥物。

1.2 方法

1.2.1 BMD測定 采用雙能X線BMD測定的方法(美國Lunar公司),由專職人員測量。測第 2～4腰椎正位骨密度,準確定位后開始掃描,由微機自動分析及打印結(jié)果。

1.2.2 DNA提取 利用常規(guī)酚-氯仿抽提法從全血中提取DNA。

1.2.3 引 物 設(shè) 計 參 照 文 獻〔2〕:P1:5′-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3′;P2:5′-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3′。

1.2.4 PCR擴增體系與參數(shù) 反應(yīng)的總體積 25μl,含模板150 ng,兩端引物各 6 pmol,TaqDNA聚合酶 0.5 U,d NTP(25mmol/L)0.4μl及相應(yīng)的緩沖液(含 MgCl220 mmol/L),無菌去離子水。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性 3 min,然后 95℃變性,50 s;退火 60℃,50 s;72℃延伸 1 min,30個循環(huán),最后延伸5 min。

1.2.5 限制性片段長度多態(tài)性(PFLP)分析 取 PCR擴增產(chǎn)物 15μl,加入 4 U Fok1限制性內(nèi)切酶及相應(yīng)的緩沖液,37℃水浴 3 h。酶切產(chǎn)物于2.5%含EB的瓊脂糖凝膠上電泳后,用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析其基因型。分型標(biāo)準:FF型為 265 bp一個片段;Ff型為 265 bp,196 bp,69 bp三個片段;基因型 ff為196bp,69 bp兩個片段。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用基因計數(shù)法分別統(tǒng)計兩組樣本基因型和等位基因的分布頻率。應(yīng)用 SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析。分析兩組人群VDR Fok 1等位基因頻率分布是否符合 Hardy-Weinberg平衡定律及兩組組間的基因型和等位基因分布頻率差異用 χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果 通過限制性內(nèi)切酶 Fok1對 PCR產(chǎn)物消化后電泳確定VDR基因 Fok1多態(tài)位點基因型。VDR基因有兩個等位基因 F和 f,可組合形成 FF、Ff、ff三種基因型。見圖 1。

圖1 VDR基因 PCR-RFLP產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 兩組人群VDR基因Fok1基因型和等位基因頻率分布符合 Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.1)。兩組人群 VDR基因 Fok1基因型頻率和等位基因分布頻率的比較,見表 1。

表1 兩組VDR基因 Fok 1基因型頻率和等位基因分布頻率

3 討 論

VDR基因 Fok 1多態(tài)性的兩種等位基因產(chǎn)生兩種不同的mRNA,從而翻譯出兩種不同的 VDR蛋白質(zhì),VDR數(shù)量和活性的改變均會導(dǎo)致靶器官效應(yīng)的明顯不同。歐美和日本研究者報告 VDR基因 Fok 1多態(tài)位點 ff基因型具有較低的 BMD值。如法國 Lucotte等〔3〕發(fā)現(xiàn) 45～75歲年齡組絕經(jīng)婦女 ff型 BMD顯著低于 FF型(10.7%),VDR基因 Fok1多態(tài)性與BMD有關(guān)聯(lián)。Arai等〔4〕報告日本未絕經(jīng)婦女 ff型腰椎 BMD較 FF型低12%。另外,有部分研究未能證實 Fok 1多態(tài)性與骨質(zhì)疏松具有相關(guān)性。如我國北京章振林等〔5〕的研究未發(fā)現(xiàn)此相關(guān)性。

目前有關(guān)內(nèi)蒙古地區(qū)老年女性的VDR基因 Fok1多態(tài)性與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性研究少有報道。本研究結(jié)果提示就目前調(diào)查例數(shù)而言,VDR基因翻譯起始位點的 Fok1多態(tài)性和老年女性 BMD有一定關(guān)聯(lián),這對于該地區(qū)骨質(zhì)疏松發(fā)病機制及診治具有重要意義。同時,由于樣本例數(shù)較少,還需進一步增加樣本數(shù)等來加以深入研究?？傊?VDR基因Fok1多態(tài)性與OP的相關(guān)性研究,還涉及研究對象的種族、民族、生活環(huán)境、營養(yǎng)狀況、年齡、絕經(jīng)年限等眾多因素。通過本次研究,得到的初步結(jié)果將有助于將有助于對我國老年 OP基因與環(huán)境、預(yù)防措施與治療策略等的深入研究。

1 Morrison NA,Qi JC,Tokita A,et al.Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles〔J〕.Nature,1994;367:284-7.

2 邢少姬,周立社,許秀舉,等 .蒙古族人群維生素 D受體基因 Fok1多態(tài)性〔J〕.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2006;23(2):236-7.

3 Lucotte G,Mercier G,Burckel A.The Vitamin D receptor Fok 1 start codon polymorphism and bone mineral density in Osteoporotic Postmenopausal French Women〔J〕.Clin Genet,1999;56(3):221-4.

4 Arai H,Miyamoto K,Taketani Y,et al.A Vitamin D receptor gene polymorphism in the translation initiation codon:effect on protein activity and relation to bone mineral density in Japanese women〔J〕.J Bone Miner Res,1997;12(6):915-21.

5 章振林,孟迅吾,周學(xué)瀛,等.北京地區(qū)漢族婦女維生素 D受體基因和降鈣素受體基因多態(tài)性與骨密度的關(guān)系〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志,2002;18(2):90-4.

6 章振林,趙金秀,孟迅吾,等.維生素 D受體基因起始密碼和 3′端多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女骨密度的關(guān)系〔J〕.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2003;20(1):5-8.