張國強 劉思源 耿春杰 王正想 高順強 左連富

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院皮膚科,河北 石家莊 050011)

惡性黑色素瘤(MM)是一種黑色素細胞惡性腫瘤,平均發(fā)病年齡為 45歲,50歲以后隨年齡增長而增高。外科手術仍是治療的首選方法,但手術預后較差,達卡巴嗪和順鉑等化療效果亦不佳〔1〕,有效率低于 25%,尋求更為有效的藥物進行系統(tǒng)治療具有重要意義。三氧化二砷(As2O3)在治療急性早幼粒細胞白血病方面取得成功以后,人們開始研究其抗癌機制,發(fā)現(xiàn)As2O3可能通過誘導細胞分化與凋亡、阻滯細胞周期、抗腫瘤血管生成及調(diào)節(jié)多種基因表達而發(fā)揮其抗腫瘤作用〔2,3〕。最近的研究表明 As2O3可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)P65核蛋白和 C-IAP2基因的表達誘導黑色素瘤細胞凋亡〔4〕。As2O3誘導黑色素細胞凋亡是否還存在其他傳導通路,是否上調(diào)或下調(diào)其他基因而發(fā)揮作用值得進一步研究。多西芬氧化酶(PPO)基因是一個新癌基因,研究顯示該基因在 MM組織中存在過表達,與細胞增殖關系密切〔5〕。國內(nèi)外尚無研究 PPO基因在黑素瘤(A375)細胞株表達情況的報告。本研究以體外培養(yǎng)的A 375細胞為研究對象,觀察 As2O3對 A 375細胞生長的影響,研究 PPO基因在A375中的表達情況,探討該藥對人A375細胞癌基因PPO表達的影響,以期為MM的臨床治療提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人惡性MM細胞株 A375(購自北京中科院科研中心);免疫細胞化學試劑 PPO多克隆抗體(鼠抗 PPO IgG)武漢晶賽生物制劑公司生產(chǎn);免疫細胞化學試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司;As2O3(購自哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司,國藥準字 H19990191,10 ml/支,每支含 As2O310 mg);DMEM購自美國 Hyclone公司;胎牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司。倒置相差顯微鏡為日本 Nikon公司,酶標儀為鄭州博塞生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將 A 375細胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素 100 U/ml,含鏈霉素 100 U/ml,pH7.2)中,置于 37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT比色法檢測As2O3對 A375細胞的影響 取對數(shù)生長期的細胞,用加樣槍鋪 96孔板。培養(yǎng) 6 h,待細胞完全貼壁后加藥。設空白對照組(內(nèi)無細胞只加培養(yǎng)基)﹑陰性對照組(單細胞懸液不加任何藥物干預)和 As2O3組,As2O3組按下列濃度分 3組(1、5、10 μmol/L),分別作用 24、48和 72 h。于培養(yǎng)結(jié)束前 4 h,各培養(yǎng)孔加入 MTT(5μg/ml)10μl,培養(yǎng) 4 h后,用全自動酶標儀于波長 570nm處測定各孔吸光度值,所有試驗重復 3次,并根據(jù)公式計算細胞的抑制率(毒性指數(shù),CI)。CI=(1-試驗組 OD值/對照組 OD值)×100%。

1.2.3 流式細胞技術(FCM)檢測細胞周期及凋亡 取同時傳代至指數(shù)生長期的瓶裝細胞,制備單細胞懸液,將細胞懸液分到 4個培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。12 h后,隨機分為陰性對照組、As2O3(1、5、10μmol/L)組,共 4組。棄舊培養(yǎng)基加入藥物進行干預,每瓶培養(yǎng)基的最終體積均為 5 ml,繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng) 48 h后,按順序分別收集各組的培養(yǎng)液。將細胞懸液按照一一對應的關系吸入相應離心管中,離心。離心完畢后去上清液,緩慢加入 4℃、70%的冷乙醇 2～3 ml,4℃冰箱中固定24 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞,離心,1 000r/min,4 min,離心完畢后棄上清液。加入 1 ml碘化丙啶(PI)染液一步插入法進行 DNA染色,0～4℃保存 30 min,500目銅網(wǎng)過濾后上機測定。

1.2.4 倒置相差顯微鏡觀察各組藥物處理后對人A 375細胞的細胞分化及形態(tài)的影響 取同時傳代至指數(shù)生長期的瓶裝細胞,接種于鋪有蓋玻片的 6孔板中,放入溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后,隨機分為陰性對照組、As2O3(1、5、10μmol/L)組,共 4組。加入藥物進行干預,陰性對照組加入含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,每孔培養(yǎng)基的最終體積均為3 ml,繼續(xù)放入 37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng) 48 h后固定,在固定細胞的過程中,將 6孔板放在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.5 免疫細胞化學法檢測PPO蛋白的表達 免疫組化法(SP)染色。PPO結(jié)果判定:陰性(-):胞漿無棕色顆粒著染者,細胞不著色;陽性(+):細胞質(zhì)可見少許棕色顆粒,細胞呈紅色;強陽性(?):在多數(shù)的細胞胞漿內(nèi)見有明顯棕色顆粒著染,細胞呈深紅色。每張爬片于高倍鏡下隨機觀察 5個視野,計算陽性細胞占計數(shù)細胞總數(shù)的百分比。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理,計量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間比較采用 LSD-t檢驗;計數(shù)資料采用百分比表示,比較進行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 As2O3對人 MM細胞 A 375增殖抑制的影響 MTT法測定結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,As2O3在 1～10μmol/L濃度范圍內(nèi)對 A375細胞有明顯的增殖抑制作用,呈現(xiàn)明顯的劑量和時間依賴效應關系。統(tǒng)計分析表明,在 24、48、72h三個時間段內(nèi),As2O3對人A375細胞的抑制作用隨著濃度的增加而增加,且以 10μmol/L濃度組作用 72 h的抑制率最高。As2O3作用 24h后,1、5、10μmol/L濃度組對 A 375細胞的抑制率分別為 4.60%、43.20%、56.29%;As2O3作 用 48 h后,1、5、10μmol/L濃度組對 A 375細胞的抑制率分別為 6.79%、46.76%、56.65%;As2O3作用 72 h后,1、5、10.0 μmol/L濃度組對 A 375細胞的抑制率分別為 57.77%、74.43%、84.58%。與對照組之間及相鄰藥物作用組之間的抑制率相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表 1。

2.2 FCM檢測細胞凋亡及細胞周期分布 As2O3可影響細胞的 DNA的合成,改變細胞周期和信號傳導途徑,使細胞在S期停滯。本研究應用低分子量 DNA抽提后 PI染色法(Sub-G1法)標記細胞,然后用 FCM進行定量檢測。FCM可根據(jù) DNA含量快速計算出細胞各期分布的百分比和凋亡率。A 375細胞經(jīng) 5μmol/L As2O3作用 48 h后,處于 S、G1、G2/M各期的細胞比率分別為 68.70%、18.80%、12.50%,與對照組 22.90%、60.80%、16.30%相比差異具有顯著性(P＜0.01)。FCM結(jié)果表明,As2O3能誘導A375細胞凋亡,隨著時間的延長凋亡細胞數(shù)目增加。隨著濃度的增加凋亡細胞數(shù)目增多。見表 2。

表1 As2 O3對 A375細胞增殖的抑制作用(%,±s)

表1 As2 O3對 A375細胞增殖的抑制作用(%,±s)

1)與對照組比較,2)與前一濃度組比較,3)與前一時間點比較:P＜0.01,下表同

對照組 1.21±0.12 0.85±019 0.49±0.07 As2 O3 1.0 4.60±0.611) 6.79±0.581)3)57.77±1.341)3)As2 O3 5.0 43.20±1.171)2)46.76±1.721)2)3)74.43±2.551)2)3)As2 O3 10.0 56.29±0.121)2)56.65±2.361)2)3)84.58±3.761)2)3)

表2 As2 O3對 A 375細胞周期及凋亡率的影響(%,±s)

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2.3 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化 陰性對照組細胞貼壁良好,呈梭形或多角形,可見偽足,大小一致,胞膜完整,光滑,有光澤,胞體狹長,透亮,胞漿飽滿﹑均勻,折光性好,中央有圓形或橢圓形的胞核,細胞增殖快速。經(jīng) As2O3作用后,可觀察到部分細胞雙極性改變,另有細胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變,細胞散在分布,細胞明顯皺縮﹑破裂,偽足消失,失去原有形態(tài),折光性減弱,細胞生長緩慢,隨著作用的時間延長,細胞數(shù)目較對照組明顯減少,越來越多的細胞漂浮在培養(yǎng)液中,未脫壁細胞雙極性改變相對增多。

2.4 SP法檢測As2O3對 A375細胞中 PPO蛋白表達的影響陰性對照組 A375細胞免疫細胞化學染色后PPO表達明顯,表現(xiàn)為胞漿大量棕色顆粒。分別經(jīng) 1、5、10μmol/L As2O3作用48 h后,PPO的表達均有減弱,且 10μmol/L As2O3作用時表達減弱更明顯,其細胞質(zhì)和細胞膜僅有淺棕色著色。見表 3,圖1。

表3 As2O 3對 A 375細胞 PPO蛋白表達的影響〔n(%)〕

圖1 As2 O3對 A 375細胞 PPO蛋白表達的影響(×400)

3 討 論

MM是一類惡性程度很高的黑色素細胞腫瘤,多發(fā)生于皮膚,化療效果很差〔6〕。直到現(xiàn)在各種免疫治療的療效仍不理想〔7〕,國內(nèi)外學者仍在探索更加安全有效的治療方法和藥物。As2O3能誘導多種腫瘤細胞凋亡,其機制主要有:改變線粒體膜通透性,調(diào)節(jié)凋亡相關基因表達,改變細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài),抑制端粒酶的活性和影響細胞周期等〔8,9〕。陳治文等發(fā)現(xiàn) As2O3也可誘導黑色素瘤細胞凋亡〔4〕。As2O3誘導MM細胞凋亡的機制及誘導效果值得深入研究。

MTT分析發(fā)現(xiàn),As2O3抑制 A375細胞增殖,并且在一定范圍內(nèi)有劑量依賴性。隨著作用時間的延長,對A 375細胞的增殖抑制和凋亡作用隨之逐漸增強,表現(xiàn)出一定的時間依賴性。FCM檢測了 As2O3作用A375細胞48 h后細胞凋亡率,試驗結(jié)果顯示:As2O3組監(jiān)測到明顯的細胞凋亡峰。與MTT比色法測定的腫瘤細胞抑制率相吻合,進一步表明在誘導腫瘤細胞分化的同時亦抑制其增殖。隨著藥物濃度的增加,S期的比例顯著增加,出現(xiàn) S期阻滯,提示 As2O3將 A375細胞阻滯在 S期可能是其增殖抑制的原因之一。倒置相差顯微鏡主要是利用光在通過不同物質(zhì)時的折光和物體厚度差別,產(chǎn)生衍射而引起光程變化,光程的變化又引起相位差的變化來觀察物體結(jié)構,是觀察細胞形態(tài)最基本的方法之一。在As2O3誘導A375細胞的過程中,動態(tài)觀察細胞形態(tài)變化時發(fā)現(xiàn):貼壁細胞不斷脫落,細胞形態(tài)呈雙極性改變,趨向良性分化,培養(yǎng)液中懸浮細胞逐漸增多?？梢?As2O3可抑制A375細胞分裂生長,改變細胞增殖動力學,降低皮膚黑色素瘤細胞株的惡性程度。

As2O3誘導A375細胞凋亡、抑制增殖可能是通過下調(diào)某些相關癌基因和某些生長有關的細胞因子的表達來實現(xiàn)的〔4,9〕。PPO基因是 2007年篩選發(fā)現(xiàn)并克隆出的一個新的癌基因,定位于人類 1號染色體末端 1p36.13區(qū),DNA長度約36 000 bp,cDNA長度 6 022 bp,共有 25個外顯子,編碼 993個氨基酸〔10～12〕。既往研究顯示該基因在 MM組織有過表達〔5〕。本研究發(fā)現(xiàn)在 A375細胞中 PPO蛋白同樣存在過表達。進一步證實 PPO基因在 MM發(fā)生發(fā)展過程中起作用,為深入研究MM的病因提供了幫助。As2O3對 MM細胞的誘導分化作用,是否通過對PPO基因的抑制而起作用?采用SP法檢測前后癌基因 PPO的表達,發(fā)現(xiàn)As2O3作用后的 A375細胞 PPO蛋白的表達明顯減弱,本文認為 As2O3對人 A375細胞的作用可能與下調(diào)癌基因 PPO的表達有關,可能是通過下調(diào)PPO的表達,阻斷絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路下游的 MEK 1/2和 ERK 2磷酸化來實現(xiàn)的,從一個新的角度探討了As2O3的抗腫瘤作用。為今后通過沉默 PPO基因以實現(xiàn)對MM A 375細胞周期和凋亡的影響提供了實驗依據(jù)。

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