商 穎，許文濤,，元延芳，梁志宏，石 慧，翟志芳，張雅楠，羅云波,，黃昆侖,,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，北京 100083)

通用引物多重PCR技術(shù)檢測3種病原微生物

商 穎1，許文濤1,2，元延芳2，梁志宏2，石 慧1，翟志芳1，張雅楠2，羅云波1,2，黃昆侖1,2,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，北京 100083)

為尋找快速且準確的病原微生物檢測方法，在普通多重PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)的基礎(chǔ)上研究一種新的通用引物多重PCR(universal primers-multiplex PCR，UP-M-PCR)技術(shù)。利用該技術(shù)對食品中主要的3種致病菌——大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌進行同時檢測，經(jīng)過單重PCR驗證、二重以及三重UP-PCR反應(yīng)條件和體系優(yōu)化。結(jié)果表明，該方法的最低檢測限為0.5pg目標DNA，復(fù)合引物和通用引物的加入量分別為2nmol/L和300nmol/L。此方法檢測靈敏度高、病原菌檢測限低，可在實踐中應(yīng)用。

大腸桿菌；單增李斯特菌；沙門氏菌；通用引物；多重PCR

食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，食品安全關(guān)系到人體健康和國計民生，食源性致病菌檢驗更是食品安全檢驗的重中之重。近些年來，世界范圍內(nèi)大規(guī)模的生物性污染引起的食源性疾病爆發(fā)事件屢屢發(fā)生，如日本的出血性大腸埃希菌O157:H7污染、法國的李斯特菌中毒、美國的沙門氏菌屬污染等，食品安全已成為世界性公共衛(wèi)生問題，而以上3種菌也是存在于食物中并且導(dǎo)致食源性疾病的最主要病原菌[1]。

目前對食源性致病菌的檢測仍主要依靠傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)、血清學、生化鑒定等方法，這些方法不但檢測周期長，而且操作繁瑣復(fù)雜，特異性、靈敏度均較低，無法對人工難以培養(yǎng)的病原細菌進行檢測[2-3]，以上缺點都限制了傳統(tǒng)檢測方法的應(yīng)用。隨著現(xiàn)代免疫學和分子生物學理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)因其特異性強、靈敏度高、操作簡單，而被廣泛應(yīng)用于食品病原細菌的檢測中。由于單一PCR檢測成本高，食品樣品中往往存在的病原細菌種類很多，有可能涉及不同種和型別的細菌，人們進而開發(fā)了多重PCR技術(shù)[4-6]。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進并發(fā)展起來的一種新型PCR擴增技術(shù)，是在同一反應(yīng)體系中加入多對引物同時擴增多條目的DNA片段的方法[7-8]。但是，通常情況下由于引物的性質(zhì)差異，每個特異性引物的擴增效率不同，擴增產(chǎn)物比例不一致，使得有些目的基因得不到清晰的擴增條帶，有時也會出現(xiàn)假陽性[9]。

本研究在普通多重PCR的基礎(chǔ)上，建立起一種通用引物——多重PCR技術(shù)(universal primer-multiplex PCR，PU-M-PCR)，此技術(shù)可以克服普通多重PCR擴增效率不一致等的缺點，提高檢測靈敏度，降低檢測成本和檢測限，從而為簡便、快速、準確的檢測病原微生物提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 菌株以及培養(yǎng)

沙門氏菌Salmonella spp.(strains CGMCC 1.0090和CGMCC 1.1552) 中國科學院微生物所；單增李斯特菌L. monocytogenes(strains CMCC 55004和CMCC 55007) 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；非致病性大腸桿菌E. coli (BL21)和E. coli (JM109) 本實驗室分離；E. coli O157:H7 EDL933中國預(yù)防醫(yī)學科學院流行病微生物學研究所景懷奇研究員饋贈。

菌株凍干粉的活化條件：LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母浸粉、10g/L NaCl和15g/L瓊脂)或胰酶解大豆酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(胰酶解大豆酪蛋白肉湯、18g/L瓊脂)、37℃過夜培養(yǎng)。

活化后細菌的培養(yǎng)條件：選取單菌落于50mL LB液體培養(yǎng)基或500mL胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基，200r/min搖床培養(yǎng)20～22h。

1.2 基因組DNA提取

表1 引物序列Table1 Primer sequences used in this study

純菌培養(yǎng)物基因組提?。?mL菌懸液(OD＞1.8) 8000r/min離心5min，1.5mL PBS緩沖液洗滌沉淀并且重懸，反復(fù)兩次。采用優(yōu)化的CTAB法提取細菌基因組DNA[10-11]。

將基因組DNA溶于300μL TE緩沖液；采用Wizard DNA Purification Kit(美國普洛麥格公司)對DNA進行純化；純化后，用 Pico Green試劑對DNA進行熒光定量。特異性和靈敏性測試時，用雙蒸水稀釋目的基因組。

1.3 引物序列

大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌的特異引物分別為Ecoli 670-F/R、LM404-F/R、Sal284-R/F[12-14]。UPM-PCR體系中，用于檢測大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌的復(fù)合引物在以上3種特異性引物5′端接上一段新序列——CCTTCCTTCCTTCCCCCC，此序列即為本研究新PCR體系中的通用引物UP。各引物序列如表1所示。

1.4 復(fù)合引物單重PCR特異性驗證

復(fù)合引物是在普通特異性引物的5′端接上一段序列，其特異性與普通引物特異性是否一致，以及擴增產(chǎn)物片度大小是否相同有待于對比。在此部分的研究中同時進行兩組對比實驗，其中反應(yīng)體系中，一組的引物為普通引物，另一組為復(fù)合引物，其余試劑均相同。熱循環(huán)程序為：94℃變性5min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、50s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.5 通用引物多重PCR(UP-M-PCR)反應(yīng)原理及反應(yīng)條件

與普通多重PCR體系相比，UP-M-PCR體系中除了含有3對目的基因復(fù)合特異性引物之外，還含有一對通用引物UP。在PCR反應(yīng)的前10個循環(huán)，復(fù)合引物主要發(fā)揮作用，進行擴增，而通用引物UP由于沒有目標模板，無法進行擴增。當特異性引物用盡，擴增產(chǎn)物得到一定程度的積累，通用引物開始以得到的產(chǎn)物為模板，進行序列擴增。本研究對此方法的可行性進行驗證。

UP-M-PCR體系中，復(fù)合引物的特異性根據(jù)溫度溶解曲線-SYBR GREENⅠPCR方法測試[11]，并且采用單重、二重、三重PCR對3種引物的比例進行優(yōu)化。由于PCR反應(yīng)中，鎂離子的濃度是影響擴增特異性的一個重要因素[15-17]，因此，在UP-M-PCR體系中MgCl2含量為1.8mmol/L，比單重PCR含量稍高。優(yōu)化后的體系為1.8mmol/L MgCl2、200μmmol/L dNTPs和1.5U DNA聚合酶、300nmol/L通用引物、2nmol/L每個復(fù)合引物。模板加入量從500、50、5、0.5、0.05pg依次進行測試，反應(yīng)總體系為30μL，剩余體積用雙蒸水補齊。

采用梯度PCR進行退火溫度的優(yōu)化，退火溫度范圍為56～64℃。最終熱循環(huán)程序為：94℃變性5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、50s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

普通多重PCR中不含通用引物，除了特異引物的含量為300nmol/L，其他試劑量與UP-M-PCR體系相同。熱循環(huán)程序為：94℃變性5min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、50s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合引物特異性驗證

由于復(fù)合引物是在普通引物的5′端加了一段通用引物序列，因此通用引物擴增得到的產(chǎn)物片段較普通引物擴增的產(chǎn)物片段大36bp，所以2、3、4泳道的條帶較5、6、7泳道的條帶位置略低。此部分研究的結(jié)果如圖1所示，每一對引物都得到相應(yīng)特異性的擴增條帶，且目的條帶的亮度相似。說明復(fù)合引物與普通引物對目的片段的特異性一致。

圖1 復(fù)合引物特異性驗證Fig.1 Verification of the specificity of composite specific primers

2.2 通用引物單重PCR可行性驗證

此部分的研究中，一組單重PCR反應(yīng)體系中只加入復(fù)合引物，另一組反應(yīng)體系除了加入復(fù)合引物外，還加入了通用引物，結(jié)果如圖2、3所示。由圖可知，當復(fù)合引物加入量降低到2nmol/L時，已經(jīng)得不到擴增條帶。而當復(fù)合引物量為2nmol/L，同時加入300nmol/L通用引物，得到的條帶依然非常清晰，與圖2第2泳道得到的擴增產(chǎn)物量相當。因此，為了優(yōu)化UP-M-PCR反應(yīng)體系，復(fù)合引物和通用引物的加入量即可分別定為2nmol/L和300nmol/L。

圖2 復(fù)合引物單重PCR結(jié)果Fig.2 Composite specific primers in single PCR

圖3 通用引物單重PCR可行性驗證結(jié)果Fig.3 Feasibility of universal primers in single PCR

2.3 通用引物多重PCR可行性驗證

圖4 通用引物二重PCR可行性驗證結(jié)果Fig.4 Feasibility of universal primers in duplex PCR

在反應(yīng)體系中逐漸減少復(fù)合引物的加入量，以優(yōu)化反應(yīng)條件。結(jié)果如圖4所示，其中706bp和440bp為大腸桿菌O157和單增李斯特菌的特異性條帶。由圖可知，當兩對復(fù)合引物的加入量都在2nmol/L時，已得不到目的條帶；相反，當復(fù)合引物的加入量為2nmol/L，同時加入300nmol/L通用引物，依然可以得到非常清晰的目的條帶。此結(jié)果與2.2節(jié)得到的結(jié)果一致。

2.4 UP-M-PCR特異性和靈敏度

為研究同時加入3對復(fù)合引物是否會產(chǎn)生非特異條帶，進行4組多重UP-PCR。每組PCR反應(yīng)體系包括3對復(fù)合引物各2nmol/L、通用引物300nmol/L、模板為3種致病菌基因組DNA的混合物。結(jié)果如圖5所示，其中706、440bp和320bp分別為大腸桿菌O157、單增李斯特菌和沙門氏菌的特異性條帶，每對引物的特異性很高，在整個體系中引物對之間同時存在，沒有出現(xiàn)非特異性條帶。

圖5 UP-M-PCR特異性驗證結(jié)果Fig.5 Specificity of the developed UP-M-PCR method

圖6 UP-M-PCR靈敏度驗證Fig.6 Sensitivity of the developed UP-M-PCR method

靈敏度測試結(jié)果如圖6所示，擴增效率隨模板量減少而降低，同時條帶的清晰度也隨之下降，當模板量減少至0.05pg時，已得不到目的條帶。所以，UP-MPCR的檢測限為0.5pg目標DNA。

3 討 論

通用引物三重PCR體系中，反應(yīng)的前10個循環(huán)，復(fù)合特異性引物主要發(fā)揮作用，進行擴增，而通用引物UP由于沒有目標模板，無法進行擴增。當特異性引物用盡，擴增產(chǎn)物得到一定程度的積累，通用引物開始以得到的產(chǎn)物為模板，進行序列擴增，最終產(chǎn)生3個不同長度的目的片段。體系中，復(fù)合引物的加入量從200nmol/L減少到2nmol/L時，若不加通用引物，隨著引物量的減少，擴增條帶的清晰度依次降低，直至最后擴增不到擴增條帶。雖然復(fù)合引物的加入量僅為2nmol/L，但通過加入通用引物UP，依然可以得到非常清楚的擴增條帶。因此，復(fù)合引物的最佳反應(yīng)濃度為2nmol/L，約為普通多重PCR反應(yīng)體系中濃度的1%，而通用引物的濃度為正常濃度300nmol/L。因此，UP-MPCR體系中，總的引物含量較普通三重PCR體系更少，僅為其1/4，不僅可以節(jié)約復(fù)合引物消耗，而且通過通用引物消除不用復(fù)合引物之間的擴增性質(zhì)差異。

在對微生物的檢測中，提高靈敏度和降低檢測限一直是學者們關(guān)系的問題，在本研究中，通過對模板加入量的研究得到：當混合模板中，其中有一種目標DNA減少到0.5pg時，依然可以擴增到清晰的條帶，而且無非特異性條帶出現(xiàn)。此方法技術(shù)降低了檢測限，提高了檢測的靈敏度，為簡便、快速、準確的檢測病原微生物提供和開辟了一種新方法和手段。對保障食品安全與國民健康具有重要意義。

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Employing Universal Primers-Multiple PCR to Detect Three Pathogenic Microorganisms

SHANG Ying1，XU Wen-tao1,2，YUAN Yan-fang2，LIANG Zhi-hong2，SHI Hui1，ZHAI Zhi-fang1，ZHANG Ya-nan2，LUO Yun-bo1,2，HUANG Kun-lun1,2,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. Supervision, Inspection & Testing Center of Genetically Modified Food Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China)

A fast, accurate and novel universal primers-multiplex PCR (UP-M-PCR) method was developed to detect three common pathogenic microorganisms in food matrices simultaneously: Escherichia coli, Listeria monocytogenes and Salmonella spp. The specificity of the constructed complex primers was verified by single-PCR, and the duplex and triplex-PCR reaction systems and conditions were optimized. The developed method had a limit of detection of 0.5 pg target DNA. The additions of the complex specific primers and universal primers were 2 nmol/L and 300 nmol/L, respectively. The new UP-M-PCR method has the advantages of high sensitivity and low detection limit and can thus be applied in practice.

Escherichia coli；Listeria monocytogenes；Salmonella spp.；universal primer；multiplex PCR (polymerase chain reaction)

Q789；R446.5

A

1002-6630(2011)10-0103-04

2010-06-22

國家“863”計劃項目(2006AA10Z440)；國家自然科學基金項目(30800770)；科技部轉(zhuǎn)基因生物重大專項(2008ZX08012-001)

商穎(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品安全。E-mail：cauxwt@yahoo.cn

*通信作者：黃昆侖(1968—)，男，教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：hkl009@163.com