李 潔，余澤英，趙宗美，顏怡君，馬志剛，劉 奇

（大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

洱海下游腸道致病菌噬菌體分離與鑒定

李 潔，余澤英，趙宗美，顏怡君，馬志剛，劉 奇*

（大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

目的：分離洱海下游水體中的腸道致病菌噬菌體，了解腸道致病菌污染情況。方法：通過噬菌斑法從洱海下游水體中分離和鑒定各種腸道致病菌噬菌體。結果：成功分離出了痢疾桿菌噬菌體、傷寒桿菌噬菌體、乙型副傷寒桿菌噬菌體、大腸桿菌噬菌體4種腸道致病菌噬菌體。結論：洱海下游水體存在痢疾桿菌、傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌污染，提示需進一步加強大理周邊生活污水排放的治理工作。

腸道致病菌;洱海；噬菌體

洱海是中國7大淡水湖之一，也是云南省第2大淡水湖〔1〕。20世紀70年代以來，洱海一直遭受著各種人為的污染，并呈現(xiàn)逐年惡化的趨勢〔2〕。盡管近年來國家和當?shù)卣度肓舜罅康娜肆Α⑽锪Χ＿M行綜合治理，并取得了顯著成效，但目前對洱海腸道致病菌污染情況并不清楚。因此，本研究將通過對洱海下游（西洱河）腸道致病菌噬菌體的檢測，了解洱海水質中腸道致病菌的存在情況，從公共衛(wèi)生角度為洱海治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料噬菌體分離所用的指示菌為傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌，菌種均由大理學院基礎醫(yī)學院病原生物學綜合實驗室提供。

1.2方法

1.2.1 采集地點 采集地點選擇在洱海下游（西洱河）泰安橋水閘處進行采樣檢測，每次用無菌瓶采集水樣500 mL。

1.2.2 噬菌體的分離 各標準菌株在普通瓊脂培養(yǎng)基上激活2次。取肉湯培養(yǎng)基20 mL（含1 mmol/ L CaCl2），加入標準菌對數(shù)期菌懸液2 mL（0.5個麥氏單位）以備擴增噬菌體。取水樣50 mL，0.22μm濾膜濾除水樣中的細菌，并將濾液加入上述含標準菌懸液的培養(yǎng)基混合培養(yǎng)（37℃振蕩培養(yǎng)24 h）擴增噬菌體。培養(yǎng)物12 000 r/min離心30 min，上清液即為噬菌體懸液，加入氯仿60μL備用。取0.1 mL上述噬菌體懸液、0.2 mL對數(shù)期標準菌懸液（0.5個麥氏單位）與3 mL 50℃的半固體普通瓊脂培養(yǎng)基混合，并快速均勻的鋪在已準備好的普通瓊脂培養(yǎng)基上（雙層瓊脂法）。37℃培養(yǎng)過夜。次日觀察是否有噬菌斑并記錄結果，并進行單斑分離純化〔3〕。

2 結果

如有噬菌體存在，可見平板上有噬菌斑形成。噬菌斑在雙層瓊脂平板為細小、形狀不規(guī)則，透明狀空斑。本研究在洱海水樣中分離出了傷寒桿菌噬菌體、乙型副傷寒桿菌噬菌體、痢疾桿菌噬菌體、大腸桿菌噬菌體。提示洱海下游水體中有相應病原體存在。

3 討論

噬菌體（bacteriophage，phage）是一類感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物病毒的總稱，在1896年-1898年，先后被英國 Hankin和俄國Gamaleya兩位細菌學家發(fā)現(xiàn)并命名〔4〕。噬菌體在自然界分布極廣，凡是有上述微生物的地方，都有相應的噬菌體存在〔5〕。噬菌體在數(shù)量上一般是細菌的10倍左右，被認為是地球上數(shù)量最多的病毒類型〔6〕。盡管噬菌體在環(huán)境中廣泛存在，但噬菌體僅侵染某一個細菌菌種或侵染一個細菌菌種內的一或兩個亞種噬菌體，由于這種嚴格的宿主特異性〔4〕，噬菌體已用于多種細菌感染性疾病的診斷和治療〔7-10〕。

由于腸道致病菌較強的傳染性，腸道致病菌引起的各種腹瀉均為國家法定傳染病〔11〕。常見腸道致病菌噬菌體已在醫(yī)院、城市排污系統(tǒng)等水體中分離成功〔12〕，但在洱海中分離腸道致病菌噬菌體尚未見報道。由于洱海與周邊及下游居民生活息息相關，其污染的危害遠遠超過其它水體。洱海是大理周邊居民的母親湖，與居民關系密切，如該水體被腸道致病菌污染，則可致洱海周邊居民和家畜被感染或攜帶致病菌，甚至引發(fā)周邊居民和旅游者腸道傳染病的感染和流行。

因此，本研究分離洱海下游各種腸道致病菌噬菌體，以判斷其遭受腸道致病菌污染的情況。實驗在采集的水樣中分離出大腸桿菌噬菌體、傷寒桿菌噬菌體、痢疾桿菌噬菌體、乙型副傷寒桿菌噬菌體共4種常見腸道致病菌噬菌體，表明該環(huán)境中存在相應腸道致病菌，提示洱海下游水體已遭受周邊居民的污染，這與焦春香等〔13〕的結論相符。洱海水體中這些腸道致病菌的存在將對周邊人畜飲水安全構成威脅，甚至存在小規(guī)模爆發(fā)相關疾病的可能性。鑒于以上結果，衛(wèi)生環(huán)保部門應進一步加強城市污水的綜合治理工作，同時醫(yī)院及基層防疫機構也應該加強對城市居民，尤其是腸道傳染病病人的健康教育，做好糞便的管理，防止對環(huán)境的污染。

〔1〕徐安倫，董保舉，劉勁松，等.洱海湖濱大氣邊界層結構及特征分析〔J〕.高原氣象，2010，29（3）：637-644.

〔2〕程艷，李柄花，此里能布，等.洱海彌苴河流域降雨侵蝕力特征研究〔J〕.中國水土保持，2008（6）：29-33.

〔3〕郭海萍，陳振輝，黃艷梅，等.污水中腸道桿菌噬菌體的分離及其生物學活性研究〔J〕.南方醫(yī)科大學學報，2007，27（10）：1545-1546.

〔4〕王梅，海榮.鼠疫噬菌體研究概述〔J〕.中國媒介生物學及控制雜志，2011，22（3）：297-300.

〔5〕蘇勝兵，馬紅霞，徐鳳宇.噬菌體在細菌性疾病診斷和治療中的應用〔J〕.中國獸醫(yī)科學，2011，41（5）：546-550.

〔6〕Weinbauer M G.Ecology of prokaryotic viruses〔J〕.Fems Microbiology Reviews，2004，28（2）：127-181.

〔7〕Cairns B J，Timms A R，Jansen V A A，et al.Quantitative Models of In Vitro Bacteriophage-Host Dynamics and Their Application to Phage Therapy〔J〕.Plos Pathogens，2009，5（1）：1-10.

〔8〕劉曉彬，王珂，成伏波，等.噬菌體對小鼠腸源性銅綠假單胞菌感染的治療作用〔J〕.吉林大學學報：醫(yī)學版，2009，35（4）：660-663.

〔9〕溫占波，李勁松.噬菌體治療細菌性疾病的研究進展〔J〕.軍事醫(yī)學科學院院刊，2008，32（2）：172-174.

〔10〕成伏波，鄭文旭，李菁華，等.噬菌體療法對燒傷合并銅綠假單胞菌感染小鼠的治療作用〔J〕.中國感染與化療雜志，2009，9（1）：18-21.

〔11〕中華人民共和國傳染病防治法〔S〕.

〔12〕徐焰，熊鴻燕，蘇明權，等.醫(yī)院內污水中噬菌體的及其生物學特性觀察〔J〕.第四軍醫(yī)大學學報，2003，24（9）：846-848.

〔13〕焦春香，劉東平，陶景麗，等.大理洱海水體糞大腸菌群污染狀況初步調查〔J〕.大理學院學報，2010，9（8）：29-30.

*通信作者：劉奇，講師.

（責任編輯 董 杰）

Isolation and Identification of Bacteriophages Specific to Intestinal Pathogen in the Water of Downstream of Erhai Lake

LI Jie,YU Zeying,ZHAO Zongmei,YAN Yijun,MA Zhigang,LIU Qi*
（School of Basic Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the distribution of intestinal bacteria in the downstream of Erhai Lake by isolation and identification phage of intestinal bacteria.Methods:Plaque method was applied to isolate and identify bacteriophages specific to intestinal pathogens in the water of Erhai Lake.Results:Bacteriophages specific to dysentery bacillus,typhoid bacillus,paratyphoid B bacteria,E.coli were successfully isolated.Conclusion:The downstream water of Erhai Lake was contaminated by dysentery bacillus, typhoid bacillus,paratyphoid B bacteria and E.coli.This suggested that it is necessary to further strengthen the management of surrounding living sewage discharge in Dali City.

intestinal pathogen;Erhai Lake;phage

R372

A

1672-2345（2011）12-0097-02

大理學院大學生科研基金資助項目（KYSX2010-051）

2011-10-12

李潔，2007級醫(yī)學檢驗專業(yè)本科學生.