宋家樂

(釜山國立大學(xué)食品科學(xué)和營養(yǎng)學(xué)科，韓國 釜山 609735)

大葉紫薇葉水提物對氧化損傷下胰腺細(xì)胞的保護作用

宋家樂

(釜山國立大學(xué)食品科學(xué)和營養(yǎng)學(xué)科，韓國 釜山 609735)

探討大葉紫薇葉水提物對氧化損傷下HIT-T15細(xì)胞的保護作用及其對胰島素分泌量的影響。通過檢測細(xì)胞內(nèi)Akt蛋白質(zhì)表達量并結(jié)合ELISA法檢測大葉紫薇葉水提物對HIT-T15細(xì)胞胰島素分泌量的影響。同時，結(jié)合細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位改變程度和抗凋亡蛋白質(zhì)Bcl-2表達量以研究其分子層面的抗凋亡機制。結(jié)果提示，大葉紫薇葉水提物可抑制氧化損傷下HIT-T15細(xì)胞的凋亡，并可改善受損細(xì)胞自身的胰島素分泌能力。

大葉紫薇；氧化損傷；抗凋亡；胰島素分泌

大葉紫薇(Lagerstroemia specious L.)又名巴拿巴(banaba)，屬千屈菜科薔薇屬落葉喬木。該植物的花、莖、果、葉皆具有傳統(tǒng)中藥的保健功效[1]。研究表明，巴拿巴水提物可顯著降低糖尿病小鼠血糖及改善小鼠體內(nèi)胰島素水平[2]，促進脂肪細(xì)胞的葡萄糖利用，抑制脂肪細(xì)胞分化[3]，減輕糖尿病小鼠體質(zhì)量[4]。近年來，巴拿巴獨特的抗糖尿病功效日益引起各國科學(xué)家的關(guān)注，其主要抗糖尿病活性成分為單寧酸、科羅索酸、熊果酸及三萜類化合物等[5-8]，但其抗糖尿病機理還不甚清楚。近年研究表明，氧化應(yīng)激損傷是糖尿病的病因之一，氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞凋亡并影響其正常的胰島素分泌功能，進而影響機體的代謝[9-10]。HIT-T15敘利亞倉鼠胰腺β細(xì)胞為常用的研究胰島素分泌機制的細(xì)胞模型[11]。 3-morpholinosydnonimine(SIN-1)又名3-瑪琳-斯得酮亞胺，為一類含亞胺的過氧化硝基化合物，可在體內(nèi)代謝生成NO和O2·。而后兩者又可生成ONOO-這一毒性自由基。為研究體內(nèi)胰腺細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷機制，本實驗以SIN-1誘發(fā)敘利亞倉鼠胰腺細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷造模，通過觀察大葉紫薇葉水提物(BWE)對氧化損傷下HIT-T15細(xì)胞的保護作用，并通過測定其對胰島素分泌量的影響，對其分子層面上抗糖尿病的機理進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大葉紫薇葉購自于韓國大邱廣域市韓藥市場。

HIT-T15敘利亞倉鼠胰腺β細(xì)胞購自美國ATCC。

RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、青-鏈霉素雙抗、0.05% Trypsin-EDTA、胎牛血清 美國Invitrogen公司；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、SIN-1、RIPA緩沖液、JC-1熒光染料 美國Sigma公司。本實驗中所有抗體均購自美國CELL Signal公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R-114旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；MCO96二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本三洋電機株式會社；VS-15CFN冷凍離心機 韓國Vision科學(xué)株式會社；PM-10AK倒置顯微鏡、BX 51 熒光顯微鏡 日本奧林巴斯光學(xué)株式會社；BIO-RAD 680酶標(biāo)儀、BIO-RAD MicroRoTofor電泳儀 美國Bio-Rad公司；CYTOMICS FC500流式細(xì)胞儀 美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 大葉紫薇葉水提物制備

取160g大葉紫薇葉加入1L蒸餾水，沸騰提取2h。0.45μm針式濾器濾過，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制得大葉紫薇葉水提物。將該水提物溶于磷酸緩沖液(PBS)制備成質(zhì)量濃度為50mg/mL的儲備液，-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 敘利亞倉鼠胰腺β細(xì)胞培養(yǎng)及氧化損傷造模

HIT-T15細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗(青-鏈霉素)的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，每3d更換培養(yǎng)基一次，待用。取適量生長期細(xì)胞，按5 × 103個/mL，每孔100μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5% CO2濕化培養(yǎng)24h。待細(xì)胞完全貼壁后，用濃度為50μmol/L的SIN-1處理細(xì)胞24h，即制備得氧化損傷細(xì)胞模型。

1.3.3 MTT法測定細(xì)胞生存率

HIT-T15細(xì)胞按5 × 103個/mL，每孔100μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5% CO2濕化培養(yǎng)24h。細(xì)胞完全貼壁后，設(shè)立空白組和樣品組進行實驗。連續(xù)培養(yǎng)48h后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基并加入150μL MTT溶液(終質(zhì)量濃度 0.5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4h。待培養(yǎng)結(jié)束后吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO-乙醇(體積比1:1)混合液，避光振蕩30min，用多孔酶標(biāo)儀于540nm波長處測定O D值，計算細(xì)胞生存率。

1.3.4 胰島素分泌量測定

HIT-T15細(xì)胞按5 × 103個/mL 接種于96孔板內(nèi)。細(xì)胞貼壁后，設(shè)空白組和樣品組，連續(xù)培養(yǎng)48h后，取10μL上清液按照試劑盒說明書操作，于450nm波長處測定OD值并計算胰島素分泌量。

1.3.5 線粒體膜電位測定

適量細(xì)胞按5×105個/mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待完全貼壁后，設(shè)立空白組、樣品組，加入JC-1(5μg/mL)熒光染料，37℃孵育20min。PBS沖洗兩次后，置于Beckman CYTOMICS FC500流式細(xì)胞儀并結(jié)合Beckman Coulter CXP2.0分析軟件測定細(xì)胞線粒體膜電位，

1.3.6 West-Blotting測定

取適量細(xì)胞，用冷PBS緩沖液沖洗兩次后，置于冰上，用RIPA細(xì)胞裂解緩沖液抽取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。經(jīng)Bio-Rad蛋白定量試劑盒定量后，取30μg細(xì)胞總蛋白，10% SDS-PAGE分離膠分離，濕法電轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃振蕩過夜，T-PBS洗膜，二抗室溫孵育1h。T-PBS洗膜后，ECL增強型化學(xué)發(fā)光法曝光并拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BWE對HIT-T15細(xì)胞的毒性作用。

MTT法檢測經(jīng)不同質(zhì)量濃度BWE處理24、48h后HIT-T15細(xì)胞生存率。如圖1所示，BWE對HIT-T15細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性作用。

圖1 大葉紫薇葉水提物對HIT-T15細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用Fig.1 Effect of BWE on cell viability of HIT-T15 cells

2.2 BWE對HIT-T15細(xì)胞氧化損傷保護的影響

圖2 BWE對HIT-T15細(xì)胞氧化損傷保護的影響Fig.2 Effect of BWE on cell viability of oxidation-damaged HIT-T15 cells

MTT法檢測不同濃度大葉紫薇葉水提物對氧化損傷(經(jīng)50μmol/L SIN-1處理)下HIT-T15細(xì)胞模型的保護作用，結(jié)果如圖2所示。大葉紫薇葉水提物可有效保護氧化損傷下HIT-T15細(xì)胞，提高其生存率。且作用效果隨提取物質(zhì)量濃度的增加而增強。50μg/mL的BWE即可有效改善氧化損傷下HIT-T15細(xì)胞的生存率(本實驗中，經(jīng)樣品處理后氧化損傷組細(xì)胞生存率大于80%視為對氧化損傷有改善作用)。

2.3 BWE對HIT-T15細(xì)胞胰島素分泌能力的影響

以50μg/mL的BWE處理HIT-T15細(xì)胞48h后，觀察其對胰腺細(xì)胞胰島素分泌能力的影響，結(jié)果如圖3A示。BWE不僅可促進正常狀態(tài)下HIT-T15細(xì)胞胰島素的分泌，同時也可改善氧化應(yīng)激損傷(50μmol/L SIN-1處理)所致胰腺細(xì)胞胰島素分泌能力的降低。此外，在細(xì)胞分子調(diào)控層面上，BWE也可降低胰島素分泌信號通路中負(fù)調(diào)節(jié)因子絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt蛋白的表達(圖3 B)，進而促進細(xì)胞胰島素的分泌[12]。

圖3 BWE對HIT-T15細(xì)胞胰島素分泌量和Akt蛋白表達的影響Fig.3 Effect of BWE on insulin secretion and Akt expression in HITT15 cells

2.4 BWE抑制氧化損傷而造成的胰腺細(xì)胞的凋亡

以 SIN-1 (50μmol/L)處理HIT-T15細(xì)胞后，50μg/mL BWE孵育48h，檢測細(xì)胞線粒體膜電位改變程度和抗凋亡蛋白質(zhì)Bcl-2表達。如圖4A所示，BWE可緩解氧化損傷所致胰腺細(xì)胞凋亡時細(xì)胞線粒體膜電位的下降，維持線粒體膜的完整性，同時也可增強細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白質(zhì)Bcl-2的表達量(圖4B)從而遏制細(xì)胞凋亡進程[13]。

圖4 BWE對HIT-T15細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位改變和Bcl-2蛋白表達的影響Fig.4 Effect of BWE on MMP change and Bcl-2 protein expression in HIT-T15 cells

3 結(jié) 論

體外研究表明，大葉紫薇葉有很好的抗氧化活性[14-15]。近年來，隨著對2型糖尿病的深入研究，自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)所導(dǎo)致的胰腺細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是糖尿病的主要病因之一。本實驗結(jié)果提示：大葉紫薇葉水提取物可抑制自由基所致氧化損傷所引起的細(xì)胞凋亡，其可能的機制是上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白質(zhì)Bcl-2的表達量。而Bcl-2蛋白可通過維持細(xì)胞線粒體的跨膜電位(即維持細(xì)胞線粒體膜的完整性)，進而抑制凋亡過程中線粒體途徑的細(xì)胞色素C的釋放過程，最終抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13]。另一方面，大葉紫薇葉水提物還可下調(diào)Akt蛋白的表達量，抑制其在胰島素分泌信號通路中的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，進而促進胰島素的分泌。為大葉紫薇葉作為一種天然抗糖尿病藥物提供了分子層面上的依據(jù)。

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Protective Effect of Water Extract from Lagerstroemia specious L. Leaves on Oxidation-damaged HIT-T15 Pancreatic Cells

SONG Jia-le
(Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, Pusan 609735, South Korea)

In this study, the protective effect of water extract from Lagerstroemia specious L. (Banaba) (BWE) on insulin secretion in oxidation-damaged HIT-T15 pancreatic cells was explored. Insulin secretion was determined by ELISA assay, and the BWE-induced insulin secretion capability was evaluated by Western-blotting. The anti-apoptotic capability of BWE was analyzed by mitochondria membrane potential (MMP) change and Bcl-2 protein expression. Results indicated that BWE could enhance insulin secretion and inhibit oxidative stress-induced cell apoptosis in HIT-T15 pancreatic cells.

Lagerstroemia specious L.；oxidation-damaged；anti-apoptosis；insulin secretion

R931.71

A

1002-6630(2011)03-0238-03

2010-06-11

宋家樂(1983—)，男，博士研究生，研究方向為分子營養(yǎng)學(xué)、植物化學(xué)。E-mail：bio.paul@hotmail.com