陳永紅，黃夏寧，鄒志飛，谷康定，王 嵐，劉慧智

曲酸遺傳毒性的研究

陳永紅1，黃夏寧2，鄒志飛1，谷康定2，王 嵐1，劉慧智1

(1.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，湖北 武漢 430030)

目的：研究曲酸遺傳毒性及有關(guān)作用機(jī)制。 方法：采用小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)染色體損傷。用不同質(zhì)量濃度曲酸(0、500、1000、1500、2000、2500μg/mL)誘導(dǎo)CHO-K1細(xì)胞，單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CHO-K1細(xì)胞DNA損傷。 結(jié)果：1/2 LD50、1/4 LD50和1/8 LD50不同劑量曲酸誘導(dǎo)昆明小鼠微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各質(zhì)量濃度受試組與陰性對(duì)照組差別無(wú)顯著性。單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示：曲酸作用質(zhì)量濃度為 1000μg/mL，作用時(shí)間為6h時(shí)，即出現(xiàn)輕微DNA損傷；當(dāng)曲酸作用質(zhì)量濃度增大到2500μg/mL時(shí)，出現(xiàn)明顯的DNA損傷。在24h內(nèi)，或其他同一作用時(shí)間段，隨著曲酸作用質(zhì)量濃度增加，DNA損傷也呈增加趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)有明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論：體內(nèi)小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)未觀察到曲酸明顯的遺傳毒性，但體外實(shí)驗(yàn)高質(zhì)量濃度曲酸在一定時(shí)間可導(dǎo)致DNA損傷。

曲酸；傳代細(xì)胞株；微核實(shí)驗(yàn)；單細(xì)胞凝膠電泳

曲酸作為一種皮膚增白劑、食品添加劑、抗菌殺蟲(chóng)劑和皮膚病治療劑，獲得廣泛應(yīng)用。最近，有關(guān)曲酸可能引起肝臟、甲狀腺損害，甚至導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，引起了人們的不安[1-4]。國(guó)外早期雖然比較詳細(xì)研究了曲酸的毒性和機(jī)制，并認(rèn)為其相對(duì)安全，但是有關(guān)最新的遺傳毒性、致畸、致癌實(shí)驗(yàn)等結(jié)果和毒性機(jī)制，則動(dòng)搖了原有的認(rèn)識(shí)。人們對(duì)待曲酸的安全性仍然存在很多疑問(wèn)、混淆和不解之處，有關(guān)曲酸毒性機(jī)制更深入、更本質(zhì)的研究從來(lái)沒(méi)有停止。本研究以曲酸為受試物，以昆明種小鼠為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，CHO-K1細(xì)胞為體外實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，考察曲酸對(duì)上述不同生物體系的遺傳毒性和可能作用機(jī)制，為系統(tǒng)研究曲酸的安全性、闡述其毒性機(jī)制提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

健康SPF昆明小鼠購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前1周購(gòu)買(mǎi)并妥善喂養(yǎng)，觀察小鼠健康狀態(tài)；CHO-K1細(xì)胞 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室。

曲酸(kojic acid) 美國(guó)Sigma 公司；1640培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；環(huán)磷酰胺 美國(guó)Alfa公司。姬姆薩(Giemsa)染料、羧甲基纖維素鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖 美國(guó)Promega公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

BX51TF熒光顯微鏡 日本Olympus公司；DYY6C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)

參照參考文獻(xiàn)[5]。取7～12周齡，體質(zhì)量25～30g小鼠，雌雄各25只。隨機(jī)分組，每組用兩種性別動(dòng)物至少各5只。受試物設(shè)3個(gè)劑量組，最高劑量組取1/2 LD50(LD50=5100mg/kg，以體質(zhì)量計(jì))，分別取1/4LD50和1/8LD50，作為中、低劑量組。實(shí)驗(yàn)共分為5組：陰性對(duì)照組(質(zhì)量濃度5mg/mL羧甲基纖維素鈉)、陽(yáng)性對(duì)照組(6mg/mL 環(huán)磷酰胺)、高劑量組(1/2LD50，5mg/mL羧甲基纖維素鈉配制127.5mg/mL曲酸溶液)、中劑量組(1/4 LD50，5mg/mL羧甲基纖維素鈉配制63.75mg/mL曲酸)、低劑量組(1/8LD50，5mg/mL羧甲基纖維素鈉配制31.875mg/mL曲酸)。

各組溶液均按0.2mL/10g灌胃。染毒途徑和方式：經(jīng)口灌胃，采用30h兩次給藥法，即兩次給受試物間隔24h，第二次給受試物后6h取材。取胸骨骨髓涂片、染色、觀察計(jì)數(shù)。

用雙盲法閱片。每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示。

觀察嗜多染紅細(xì)胞(PCE)與成熟紅細(xì)胞(RBC)比值，可作為細(xì)胞毒性指標(biāo)之一。一般計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞。

1.2.2 堿性單細(xì)胞凝膠電泳

CHO-K1細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮罐中取出凍存的CHO-K1細(xì)胞，置40℃迅速融化，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)入離心管加無(wú)血清培養(yǎng)基，1000r/min離心2min。去上清液，加入適量10% 1640完全培養(yǎng)基，吹散細(xì)胞后計(jì)數(shù)，按適合密度轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，然后棄去上清液加入新的完全培養(yǎng)基。

CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)：待CHO-K1細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，收獲細(xì)胞。倒去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，3mL D-Hank’s溶液潤(rùn)洗細(xì)胞1次，倒去溶液，1mL 0.25%胰酶消化細(xì)胞1.5min，倒去溶液，加入10mL 10%血清RPMI 1640完全培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕將培養(yǎng)瓶壁上的細(xì)胞吹下，輕輕吹打混勻，于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種細(xì)胞，至少接種4板。

CHO-K1細(xì)胞染毒：細(xì)胞在6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，按曲酸終質(zhì)量濃度為0、500、1000、1500、2000、2500 μg/mL染毒，分別培養(yǎng)6、12、24、48h后投入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

堿性單細(xì)胞凝膠電泳：吸棄6孔細(xì)胞培養(yǎng)板原培養(yǎng)液后，用2mL D-Hank’s 潤(rùn)洗細(xì)胞，0.25%胰酶分散細(xì)胞，每孔加1mL 10%血清1640 培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至另一EP管，計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞數(shù)，保證每管100000個(gè)細(xì)胞(1mL)。4℃、1400r/min低溫離心5min，輕輕移去上清液，重復(fù)懸浮、離心一次，再定容為1mL細(xì)胞懸液。3層瓊脂糖制片，其中取10μL細(xì)胞懸液與75μL(0.7%)低熔點(diǎn)瓊脂糖混勻鋪片，4℃裂解1.5h，4℃解旋20min，電泳25min(25V，300mA)，溴乙啶(EB)熒光染色、觀察、拍照和分析。每個(gè)樣本隨機(jī)選擇100個(gè)細(xì)胞，圖片保存后，用CASP彗星圖像軟件分析結(jié)果。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。微核統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Dunnett t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳毒性

2.1.1 曲酸誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞微核效應(yīng)

表1為不同劑量曲酸誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞微核結(jié)果，將陽(yáng)性對(duì)照組、曲酸各受試組與陰性對(duì)照組比較，Dunnett法t檢驗(yàn)顯示，陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組存在極顯著性差異，而1/2LD50、1/4LD50和1/8LD50曲酸各受試組與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異，雄性1/2LD50組與其他兩組曲酸結(jié)果比較稍有偏高，但沒(méi)有明顯劑量-反應(yīng)關(guān)系。

表1 曲酸誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞微核效果(x±s, n=10)Table 1 Induction of micronuclei in bone marrow of KM mice by kojic acid (x±s, n=10)

2.1.2 嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值(PCE/RBC)

將各組嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值(PCE/RBC)進(jìn)行方差分析，觀察其毒性。表2和表3顯示各組之間差異無(wú)顯著性，表明各組小鼠未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。

表2 雄性小鼠PCE/RBC比值方差分析Table 2 Variance analysis for the ratio between polychromatic erythrocytes and normochromatic erythrocytes in male mice

表3 雌性小鼠PCE/RBC比值方差分析Table 3 Variance analysis for the ratio between polychromatic erythrocytes and normochromatic erythrocytes in female mice

2.2 DNA損傷測(cè)定結(jié)果

不同質(zhì)量濃度曲酸作用CHO-K1細(xì)胞6h后，對(duì)受試細(xì)胞DNA損傷程度見(jiàn)圖1。曲酸質(zhì)量濃度在1000μg/mL以上與對(duì)照組比較，DNA損傷程度逐漸緩慢增加，到2500μg/mL時(shí)出現(xiàn)劇烈增加。

圖1 曲酸作用CHO-K1細(xì)胞6h后細(xì)胞DNA損傷情況Fig.1 DNA damage induced by kojic acid in CHO-K1 cells after 6 h incubation

不同質(zhì)量濃度曲酸作用CHO-K1細(xì)胞12h后，對(duì)受試細(xì)胞DNA損傷程度見(jiàn)圖2。曲酸質(zhì)量濃度在1500μg/mL時(shí)與對(duì)照組比較，DNA損傷程度略有增加，到2500μg/mL時(shí)出現(xiàn)劇烈增加。

不同質(zhì)量濃度曲酸作用CHO-K1細(xì)胞24h后，對(duì)受試細(xì)胞DNA損傷程度見(jiàn)圖3、4。曲酸質(zhì)量濃度在1500 μg/mL以上與對(duì)照組比較，DNA損傷程度開(kāi)始增加，到2000μg/mL以上出現(xiàn)劇烈增加。

圖2 曲酸作用CHO-K1 細(xì)胞12h后細(xì)胞DNA損傷情況Fig.2 DNA damage induced by kojic acid in CHO-K1 cells after 12 h incubation

圖3 曲酸作用CHO-K1細(xì)胞24h后細(xì)胞DNA損傷情況Fig.3 DNA damage induced by kojic acid in CHO-K1 cells after 24 h incubation

圖4 不同質(zhì)量濃度曲酸作用CHO-K1細(xì)胞24h后的電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of CHO-K1 cells treated by kojic acid in various dosages for 24 h

圖5 曲酸作用CHO-K1細(xì)胞48h后細(xì)胞DNA損傷情況Fig.5 DNA damage induced by kojic acid in CHO-K1 cells after 48 h incubation

曲酸作用CHO-K1細(xì)胞48h后，對(duì)受試細(xì)胞DNA損傷程度在1000μg/mL以上與對(duì)照組比較，即開(kāi)始明顯增加，到1500μg/mL出現(xiàn)劇烈增加，2000μg/mL和2500μg/mL損傷程度減緩，見(jiàn)圖5。

將各質(zhì)量濃度曲酸作用下的Olive尾矩均數(shù)除以空白對(duì)照的Olive尾矩均數(shù)，得比值，綜合反映其關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖6。曲酸質(zhì)量濃度為2500μg/mL，作用6h時(shí)，DNA損傷變化最大。其他時(shí)間變化相對(duì)平和。

圖6 不同劑量曲酸在不同作用時(shí)間導(dǎo)致CHO-K1細(xì)胞DNA損傷趨勢(shì)Fig.6 Dynamic change rates of DNA damage induced by kojic acid in various treatment time and dosages in CHO-K1 cells

3 討 論

不同劑量曲酸誘導(dǎo)昆明種小鼠微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各受試質(zhì)量濃度組與陰性對(duì)照組差別無(wú)顯著性。雄性1/2LD50組與其他兩組曲酸結(jié)果比較稍有偏高，但沒(méi)有明顯劑量-反應(yīng)關(guān)系。雌性小鼠各劑量組完全沒(méi)有劑量-反應(yīng)關(guān)系，表明在本研究條件下，未觀察到曲酸對(duì)小鼠染色體損害。各組嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值(PCE/ RBC)經(jīng)方差分析，各組之間差異無(wú)顯著性，表明各組小鼠未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到與本研究相似報(bào)道，國(guó)外有報(bào)道[6-7]曲酸在兩套染色體畸變測(cè)試中具有致畸變效應(yīng)，在一次姊妹染色單體交換實(shí)驗(yàn)中為陽(yáng)性。高質(zhì)量濃度下，曲酸對(duì)體外測(cè)試系統(tǒng)Hep2G細(xì)胞微核致畸效應(yīng)還不明了。曲酸單劑量或多劑量在一次體內(nèi)骨髓微核實(shí)驗(yàn)中，無(wú)染色體致畸作用。在轉(zhuǎn)基因小鼠基因突變測(cè)試中也未發(fā)現(xiàn)曲酸的致突變性。顯性致死實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性表明曲酸不是生殖細(xì)胞致突變劑。唯一體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性的是給藥后部分肝切除，用肝細(xì)胞進(jìn)行的微核實(shí)驗(yàn)。然而相關(guān)陽(yáng)性結(jié)果是非常有限的。以上結(jié)果與本研究結(jié)果基本吻合，可能曲酸不是一種遺傳毒物。陽(yáng)性組標(biāo)準(zhǔn)差偏高，原因系少數(shù)胸骨骨髓涂片微核數(shù)較高引起，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷，它對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不大，如果時(shí)間、人力和成本允許，重復(fù)考察該陽(yáng)性物環(huán)磷酰胺的結(jié)果可能更好。PCE/RBC為評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的指標(biāo)，受試物各組該比值與陰性對(duì)照組比較若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義表示受試化學(xué)物劑量過(guò)大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。如前所述，本研究各受試組和陽(yáng)性組經(jīng)檢驗(yàn)與陰性組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，也證明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。本研究不僅考察了曲酸對(duì)體內(nèi)(in vivo)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的影響，還同時(shí)考察了曲酸對(duì)體外(in vitro)受試對(duì)象的作用過(guò)程。

彗星實(shí)驗(yàn)是目前最為常用的體外檢驗(yàn)DNA受損的方法。本研究結(jié)果顯示曲酸作用質(zhì)量濃度為1000μg/mL，作用時(shí)間為6h時(shí)，即出現(xiàn)DNA損傷，但損傷較少，不明顯。當(dāng)曲酸作用質(zhì)量濃度增大到2500μg/mL，作用時(shí)間為6h時(shí)，與陰性對(duì)照組比較，出現(xiàn)明顯的DNA損傷。在24h內(nèi)，各劑量組隨著作用時(shí)間的增加，DNA損傷呈增加趨勢(shì)。同一作用時(shí)間段，隨著曲酸質(zhì)量濃度增加，DNA損傷也呈增加趨勢(shì)。曲酸作用48h，2000μg/mL及2500μg/mL劑量組與陰性對(duì)照組Olive尾矩(Olive Tail Moment)平均值之比出現(xiàn)下降趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)有明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。很多研究也已發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物在較長(zhǎng)時(shí)間的毒素體內(nèi)暴露后，DNA損傷的指標(biāo)并沒(méi)有顯著升高，甚至呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)镈NA損傷修復(fù)系統(tǒng)的激活和酶系統(tǒng)的反作用，或是由于隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，DNA斷裂程度較高，以致在電泳時(shí)斷片可能丟失[8]。當(dāng)然，體內(nèi)、體外染毒方式的不同，各種動(dòng)物的細(xì)胞對(duì)某種毒素的敏感度不同，將引起細(xì)胞損傷時(shí)間段和修復(fù)時(shí)間段的不同。國(guó)內(nèi)目前主要是在部分化妝品中發(fā)現(xiàn)含有曲酸增白劑，質(zhì)量濃度低于100μg/mL[9-10]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，該質(zhì)量濃度不至于導(dǎo)致DNA斷裂。而且曲酸通過(guò)皮膚轉(zhuǎn)移到血液的可能性非常小，因此尚不構(gòu)成明顯危害。日本在各類食品中的添加量為0.05%～1%，國(guó)內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)在食品中添加曲酸的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)未染毒的對(duì)照組的少量細(xì)胞也出現(xiàn)了彗星拖尾，這可能是因?yàn)殡x開(kāi)活體的細(xì)胞不可避免地會(huì)受到某些非生理?xiàng)l件的不利影響，如光線的照射等，導(dǎo)致了微量DNA在電泳中遷移。彗星圖像分析是單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)實(shí)驗(yàn)不容忽視的一部分，所選分析指標(biāo)影響SCGE的靈敏性。人工指標(biāo)易受主觀因素干擾，而計(jì)算機(jī)圖像分析如CASP軟件[11]，可進(jìn)行精細(xì)的熒光強(qiáng)度、尾矩、尾慣量等指標(biāo)的測(cè)定。Olive尾矩(Olive尾矩：從頭光密度重心到尾光密度重心的距離與尾部 DNA含量的乘積)能更好地反映DNA損傷的程度。本研究采用Olive尾矩分析不同時(shí)間、不同質(zhì)量濃度曲酸作用下單個(gè)細(xì)胞的DNA損傷程度，較傳統(tǒng)方法優(yōu)越。

綜上所述，本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)未觀察到曲酸明顯的遺傳毒性，但體外實(shí)驗(yàn)高質(zhì)量濃度曲酸在一定時(shí)間可導(dǎo)致DNA損傷，這種差異或者說(shuō)是矛盾，是否因?yàn)镈NA損傷在體內(nèi)獲得修復(fù)而未表現(xiàn)出來(lái)？還是因?yàn)轶w內(nèi)存在的代謝、轉(zhuǎn)化和結(jié)合等代謝途徑導(dǎo)致曲酸發(fā)生改變，使其不致產(chǎn)生遺傳毒性？或其他原因所致？值得深入研究和探討。

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CHEN Yong-hong1，HUANG Xia-ning2，ZOU Zhi-fei1，GU Kang-ding2，WANG Lan1，LIU Hui-zhi1
(1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510623, China；2. School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

Objective: To investigate the genetic toxicity and its mechanisms of kojic acid. Methods: Bone marrow micronucleus test in mice and comet assay in CHO-K1 cells were used to examine DNA damage. KM mice were randomly divided into 5 groups for 5 males and 5 females in each group. The KM mice were administered with kojic acid at doses of 1/2, 1/4, and 1/8 fold LD50 for examining DNA damage. CHO-K1 cells were treated with kojic acid at the concentrations of 0, 500, 1000, 1500, 2000 μ g/mL and 2500μ g/mL for comet assay at 6, 12, 24 h and 48 h, respectively. Results: After treatment with kojic acid, the ratio of micronucleus in mice did not exhibit a significant increase, compared with the negative control. The slight DNA damage in CHO-K1 cells was observed in kojic acid group at the concentration of at 1000μ g/mL after 6 h incubation. Severely DNA damage was also observed when kojic acid concentration was increased to 2500μg/mL. However, no response-time relationship was observed. Conclusion: Kojic acid at the experimental conditions did not result in genetic toxicity in bone marrow cells of treated mice, but could induce DNA damage in vitro at high concentration level.

kojic acid；cell line；micronucleus test；comet assay

R114

A

1002-6630(2011)03-0228-05

2010-06-02

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007Z3-E0381)；廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2005GDK56)

陳永紅(1966—)，女，副主任技師，博士，主要從事進(jìn)出口食品和化妝品的毒理學(xué)檢驗(yàn)研究。E-mail：chenyh@iqtc.cn