張洪江，張紅英，王 玉

馬齒莧正丁醇提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶作用的研究

張洪江1，張紅英2,*，王 玉3

(1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 延吉 133000；2.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，吉林 延吉 133002；3.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部，吉林 延吉 133002)

目的：研究馬齒莧正丁醇提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及其作用機(jī)制。方法：取小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、馬齒莧正丁醇提取物(0.5、0.25g/(kg·d))組。除正常組頸部皮下注射生理鹽水外，其他各組均皮下注射D-半乳糖(1g/(kg·d))，注射后每天下午灌胃給藥，連續(xù)造模42d。采用避暗和水迷宮法測(cè)定衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，同時(shí)測(cè)定小鼠腦組織丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性。結(jié)果：馬齒莧正丁醇提取物組均可提高衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并明顯降低腦組織MDA含量，提高SOD和GSH-Px的活性。結(jié)論：馬齒莧正丁醇提取物能明顯改善衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，其機(jī)制可能與提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量有關(guān)。

馬齒莧；正丁醇；學(xué)習(xí)記憶；MDA；SOD；GSH-Px

馬齒莧(Portulaca oleracea Linn)廣泛分布于我國(guó)南北地區(qū)，資源豐富，是一種具有很大開(kāi)發(fā)潛力的植物。馬齒莧科植物的全草又名長(zhǎng)壽菜，性寒味酸具有清熱解毒、散血消腫之功效。馬齒莧是中國(guó)衛(wèi)生部劃定的藥食同源的野生植物之一。馬齒莧含有豐富的化學(xué)成分，具有廣泛的藥理活性及營(yíng)養(yǎng)保健作用[1]。曾小玲[2]報(bào)道鮮馬齒莧沸水提取物對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基均有顯著的清除作用。馬齒莧水提液可明顯延長(zhǎng)模型小鼠的缺氧生存時(shí)間、爬桿時(shí)間，提高其高溫存活率[3]，據(jù)此推測(cè)馬齒莧提取物可能具有改善學(xué)習(xí)記憶的作用。本實(shí)驗(yàn)研究馬齒莧提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，從清除氧自由基的能力方面初步探討其作用機(jī)制。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用馬齒莧提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

馬齒莧購(gòu)于吉林省延邊大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)延邊大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室劉永鎮(zhèn)教授鑒定為真品。

昆明種小鼠(均為雌性)，體質(zhì)量24～26g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供(動(dòng)物合格證號(hào)：10-1022)。

D-半乳糖(批號(hào)F20080429) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SOD、MDA、GSH-Px試劑盒(批號(hào)2008.11.23)南京建成生物工程研究所。

2H-500型小鼠避暗儀 安徽正華教學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)械廠；LW-Π型自動(dòng)記錄水迷宮 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；YP600型電子稱、VIS-723型可見(jiàn)分光光度儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；超級(jí)恒溫水浴裝置 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧正丁醇提取物制備

稱取馬齒莧干草1300g粉碎，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇在水浴中回流提取2次，先用10倍量乙醇提取2h，然后再用8倍量乙醇提取1h，冷卻后過(guò)濾，合并濾液濃縮，水懸浮液以乙酸乙酯萃取濃縮至浸膏，水層揮盡乙酸乙酯，用飽和正丁醇萃取。正丁醇層濃縮得浸膏，干燥成粉末，臨用前配成所需濃度。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組造模及給藥

取雌性昆明種小鼠，在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)2d，隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組、馬齒莧正丁醇提取物(0.5、0.25g/(kg·d)，以體質(zhì)量計(jì))組。D-半乳糖致衰老小鼠模型的制備[4]：采用無(wú)菌注射方法，每日上午，除正常組頸部皮下注射生理鹽水外，其他各組均皮下注射D-半乳糖(1g/(kg·d))進(jìn)行造模，每日1次連續(xù)造模42d。注射D-半乳糖后每日下午，生理鹽水和模型組灌胃給蒸餾水，藥物組灌胃給馬齒莧正丁醇提取物，每日1次連續(xù)灌胃給藥42d。

1.2.3 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)[5]

避暗箱大小為36cm×12cm×12cm，分為前后明暗室兩部分，兩室間有直徑3cm的圓洞相通，底部為銅柵，暗室后半部通以40V電壓。訓(xùn)練時(shí)將小鼠背對(duì)洞口放入明室，暗室底部通電，同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，小鼠穿過(guò)洞口進(jìn)入暗室觸電的時(shí)間，為實(shí)驗(yàn)潛伏期，進(jìn)行訓(xùn)練5min，24h后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，將小鼠背對(duì)洞口放入明室，同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，記錄每只小鼠第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間，即為逃避潛伏期，并記錄5min內(nèi)進(jìn)入暗室的次數(shù)(即避暗錯(cuò)誤次數(shù))。

1.2.4 小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)[6]

裝置為32cm×12cm×25cm雙層不透明的有機(jī)玻璃槽，實(shí)驗(yàn)時(shí)水深為10cm，水溫保持25℃左右。第一次訓(xùn)練前將小鼠放在梯子附近，使其自行爬上3次，然后將小鼠背對(duì)出口放入A點(diǎn)開(kāi)始訓(xùn)練。第二次訓(xùn)練前將小鼠放在梯子附近，使其自行爬上一次，將小鼠背對(duì)出口放入B點(diǎn)開(kāi)始訓(xùn)練。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠背對(duì)出口從B點(diǎn)開(kāi)始放入小鼠，同時(shí)按下啟動(dòng)鍵，儀器開(kāi)始自動(dòng)記時(shí)，小鼠到達(dá)終點(diǎn)或時(shí)間到2min時(shí)，儀器自動(dòng)停記。

1.2.5 腦組織蛋白質(zhì)、MDA含量及SOD、GSH-Px活性的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取腦組織冰浴研磨，并用冷生理鹽水制成10%勻漿液，3500r/min離心10min，取上清液按試劑盒方法測(cè)定腦組織蛋白質(zhì)、MDA含量和SOD、GSH-Px活性(以單位質(zhì)量蛋白計(jì))。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 馬齒莧正丁醇提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(避暗法)

表1 馬齒莧正丁醇提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響Table 1 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in stepthrough test

表1 馬齒莧正丁醇提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響Table 1 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in stepthrough test

注：*.與模型組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與模型組相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

組別劑量/動(dòng)物數(shù) 避暗法測(cè)定指標(biāo)(g/(kg·d))潛伏期/s錯(cuò)誤次數(shù)正常組—1591.54±2.800.87±0.92模型組—1229.73±3.755.17±6.94提取物高劑量組0.512109.78±5.51**0.42±0.67**提取物低劑量組0.2517140.63±4.12**0.18±0.53**

由表1可知，與正常組相比，模型組小鼠潛伏期明顯縮短和錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加；與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物組均可使衰老小鼠潛伏期延長(zhǎng)和錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P＜0.01)。

2.2 馬齒莧正丁醇提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(水迷宮法)

表2 馬齒莧正丁醇提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響Table 2 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in water maze (x±s)

表2 馬齒莧正丁醇提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響Table 2 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in water maze (x±s)

組別劑量/動(dòng)物數(shù) 水迷宮法測(cè)定指標(biāo)(g/(kg·d))到達(dá)時(shí)間/s錯(cuò)誤次數(shù)正常組—1558.23±26.93**10.92±8.69**模型組—12102.36±30.5824.36±7.46提取物高劑量組0.51248.45±38.35**8.50±4.97**提取物低劑量組0.251758.25±28.41**11.50±5.68**

由表2可知，與正常組相比，模型組小鼠到達(dá)時(shí)間延長(zhǎng)和錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加；與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物組均可使衰老小鼠到達(dá)時(shí)間縮短和錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P＜0.01)。

2.3 對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px的影響

表3 馬齒莧正丁醇提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px的影響Table 3 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on SOD, MDA, and GSH-Px leve in brain tissue of senile mice induced by DGal

表3 馬齒莧正丁醇提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px的影響Table 3 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on SOD, MDA, and GSH-Px leve in brain tissue of senile mice induced by DGal

組別劑量/動(dòng)物數(shù)SO D/MD A含量/GSH-P X/ (g/(kg·d))(U/m g)(nmol/ mg)(U/ mg )正常組—1089.8±14.6*4.8±0.762.7±19.2模型組—1042.6±13.25.0±1.533.2±8.5提取物高劑量組0.51081.0±33.5*4.0±0.951.4±12.9**提取物低劑量組0.251063.5±14.73.3±0.8*48.9±19.9

由表3可知，與正常組相比，模型組小鼠腦組織SOD、GSH-PX活性下降；與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物(0.5g/(kg·d))組可使衰老小鼠腦組織SOD、GSH-PX活性明顯上升(P＜0.05，P＜0.01)；與正常組相比，模型組小鼠腦組織MDA含量明顯上升；與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物(0.25g/(kg·d))組可使衰老小鼠腦組織MDA含量明顯下降(P＜0.05)。

3 討 論

衰老是生命過(guò)程中正常而又復(fù)雜的生物過(guò)程，有關(guān)衰老的學(xué)說(shuō)很多，1956年所提出的自由基衰老假說(shuō)受到廣泛的支持[7]。

D-半乳糖致衰老小鼠模型：D-半乳糖在半乳糖氧化酶作用下，氧參與反應(yīng)，生成糖和過(guò)氧化氫反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生超氧陰離子自由基，其過(guò)量損傷可產(chǎn)生衰老反應(yīng)。該模型在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)注射D-半乳糖，使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，在醛糖還原酶催化作用下，還原成半乳糖醇，這種物質(zhì)不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，致細(xì)胞腫脹，功能障礙代謝紊亂，氧自由基堆積最終致機(jī)體衰老[7]。連續(xù)頸背部皮下注射造成衰老模型，此模型造模簡(jiǎn)單易行，不需要特殊設(shè)備，本模型基本接近自然衰老過(guò)程。

避暗法實(shí)驗(yàn)中，D-半乳糖可使衰老小鼠潛伏期明顯縮短和錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加，與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物組均可使衰老小鼠潛伏期明顯延長(zhǎng)和錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少。

水迷宮法實(shí)驗(yàn)中，D-半乳糖可使衰老小鼠到達(dá)時(shí)間延長(zhǎng)和錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加，與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物均可使衰老小鼠到達(dá)時(shí)間明顯縮短和錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少。說(shuō)明馬齒莧正丁醇提取物可提高衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為引起人體衰老的主要原因是人體細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，因其具有高度的化學(xué)性，并能與活細(xì)胞的大部分發(fā)生反應(yīng)，損傷DNA分子，造成DNA鍵的斷裂，使細(xì)胞死亡或發(fā)生突變[8]。

SOD作為機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。此酶可促使超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)氧化氫，從而減少脂過(guò)氧化反應(yīng)，使機(jī)體細(xì)胞和組織免受損害，其活力的高低間接反應(yīng)映了機(jī)體清除氧自由基的能力，并與衰老、腫瘤、炎癥等有著密切聯(lián)系[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物(0.5g/(kg·d))組能提高衰老小鼠腦組織SOD活性。

MDA是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂過(guò)氧化物，它能生成聚合物并與人體內(nèi)的蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸發(fā)生反應(yīng)，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，導(dǎo)致變異蛋白質(zhì)的細(xì)胞失去正常功能并向初期癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。MDA含量的變化可間接反應(yīng)組織中氧自由基含量的變化量[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物(0.25g/(kg·d))組可明顯降低衰老小鼠腦組織MDA含量。

GSH-Px是機(jī)體廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，它特異地催化還原型谷胱甘肽H2O2的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用，從而減緩衰老過(guò)程[11]。與模型組相比，馬齒莧正丁醇提取物(0.5g/(kg·d)) 組能提高衰老小鼠腦組織GSH-Px活性。

本次實(shí)驗(yàn)中，D-半乳糖可使衰老小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA含量有所上升，馬齒莧正丁醇提取物(0.5g/(kg·d))組可使衰老小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性明顯上升，馬齒莧正丁醇提取物(0.25g/(kg·d))組可使衰老小鼠腦組織MDA含量明顯下降。說(shuō)明，馬齒莧正丁醇提取物可能通過(guò)增加氧自由基清除能力來(lái)改善學(xué)習(xí)記憶障礙。

綜上所述，馬齒莧正丁醇提取物可提高衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量有關(guān)。

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Effects of n-Butanol Extracts from Portulaca oleracea on the Learning and Memory Performances of Senile Mice Induced by D-Gal

ZHANG Hong-jiang1，ZHANG Hong-ying2,*，WANG Yu3
(1. Clinical Laboratory Room, Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, China；2. Functional Laboratory Center, Basic Medical College of Yanbian University, Yanji 133002, China；3. Yanbian University Health Science Center, Yanji 133002, China)

Objective: To study the effects of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on the learning and memory performances of senile mice induced by D-gal and its mechanisms. Method: The mice were randomly divided into 3 groups: control group, model group and the n-butanol extracts (0.5 g/(kg·d) and 0.25 g/(kg·d)) groups. The control group was given hypodermic injection of isotonic NaCl in the transverse part while the other groups successively administered with D-gal (1 g/(kg·d)). After injection of medicine in the afternoon of every day model animals were obtained after 42 d of treatment. Learning and memory performances were measured by step-through test and water maze test and the amount of MDA in mouse brain tissue and the activities of SOD and GSH-Px were determined. Results: Portulaca oleracea n-butanol extracts could improve the learning and memory performances of mice at both 0.5 g/(kg·d) and 0.25 g/(kg·d), and substantially reduce contents of MDA in brain tissues and improve activities of SOD and GSH-Px. Conclusion: Portulaca oleracea n-butanol extracts can markedly improve learning and memory performances of senile mice. The mechanisms of effects may be related to the improvement of SOD and GSH-Px activities and the decrease of MDA.

Portulaca oleracea；n-butanol；learning and memory；MDA；SOD；GSH-Px

TS255.1

A

1002-6630(2011)03-0204-04

2010-05-31

張洪江(1968—)，男，主管檢驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幧幚?。E-mail：zhj1181@msn.cn

*通信作者：張紅英(1952—)，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幮难芘c抗衰老。E-mail：zhanghongying52@163.com