陳 琳，孟祥晨

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌代謝產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件

陳 琳，孟祥晨*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

為提高一株分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵稀奶油“焦克”中的植物乳桿菌KLDS1.0391代謝產(chǎn)細菌素量，以中性蛋白酶水解脫脂乳為培養(yǎng)基，以枯草芽孢桿菌為指示菌，以抑菌圈直徑為考察指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵pH值、溫度以及接種量。結(jié)果表明：對該菌代謝產(chǎn)細菌素的活性影響大小依次為：發(fā)酵pH值＞接種量＞發(fā)酵溫度；最優(yōu)發(fā)酵條件為：pH5.1、發(fā)酵溫度33℃、接種量1%。在此條件下，發(fā)酵液的抑菌圈直徑為15.00mm，細菌素的效價為601.32IU/mL，較優(yōu)化前提高了43.08%。在最優(yōu)發(fā)酵條件下獲得的實驗結(jié)果與模型預(yù)測值吻合，說明所建立的模型是切實可行的。

響應(yīng)面；細菌素；植物乳桿菌；焦克

“焦克”是內(nèi)蒙古的一種傳統(tǒng)發(fā)酵稀奶油產(chǎn)品，屬于自然發(fā)酵乳制品，保質(zhì)期較長，其中蘊含豐富的乳酸菌資源。乳酸菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸形成低pH值是其能夠較長時間保藏的主要原因，其次，乳酸菌代謝產(chǎn)生的具有抑菌活性的物質(zhì)，如細菌素，也有利于這種產(chǎn)品的保藏[1]。在前期研究中筆者分析了從“焦克”中分離的67株乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的能力，發(fā)現(xiàn)4株乳桿菌具有較強的產(chǎn)抑菌物質(zhì)的能力，經(jīng)排除干擾因素后確定主要的抑菌物質(zhì)為細菌素。其中，植物乳桿菌KLDS1.0391代謝產(chǎn)生的植物乳桿菌素MG不僅可以抑制單細胞增生利斯特氏菌等革蘭氏陽性細菌，還可抑制沙門氏菌等革蘭氏陰性細菌，該細菌素是具有良好熱、酸穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)性物質(zhì)[2]，在食品中有良好的應(yīng)用前景。

乳酸菌代謝產(chǎn)生細菌素的能力和產(chǎn)量，除了受菌株自身特性的影響，還受發(fā)酵條件的影響，如培養(yǎng)基、發(fā)酵pH值[3]、發(fā)酵溫度[4]以及接種量[5]等。本研究以分離自“焦克”的植物乳桿菌KLDS1.0391為研究對象，以前期優(yōu)化的酶水解脫脂乳為培養(yǎng)基，通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件，獲得該菌代謝產(chǎn)生細菌素的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，為該細菌素的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)KLDS1.0391分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵稀奶油，由乳品科學(xué)教育部重點實驗室工業(yè)微生物菌種保藏中心凍干保藏。指示菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC6633購自中國藥品生物制品檢定所。

MRS培養(yǎng)基 英國Oxoid公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

脫脂乳(蛋白質(zhì)含量為35%) 新西蘭Karicare公司；中性蛋白酶(酶活力為0.8AU/g) 北京諾維信公司；乳鏈球菌素Nisin(含Nisin 2.5%) 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KLF2000 3.7L發(fā)酵罐 瑞士比歐生物工程公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；ES-2030冷凍干燥機 日本日立公司；HVE-50型高壓滅菌器 日本Hirayama公司；BCN1360型生物潔凈工作臺 上海佳勝實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與培養(yǎng)

植物乳桿菌KLDS1.0391經(jīng)活化傳代恢復(fù)活力后，以1%接種量接入MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h。

枯草芽孢桿菌ATCC6633經(jīng)活化傳代恢復(fù)活力后，以0.3%接種量接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)18h。

1.3.2 發(fā)酵液抑菌活性的測定

無細胞發(fā)酵上清液的制備：取發(fā)酵液于4℃、12000×g離心15min，收集上清液，用6mol/L NaOH調(diào)pH6.5，以中和有機酸的干擾，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，除去菌體及其他雜質(zhì)，然后冷凍干燥，凍干后取1g凍干樣品加入1mL滅菌雙蒸水，溶解后放入-20℃冰箱中備用。

采用雙層平板打孔法測定抑菌活性[6]。配制質(zhì)量濃度1.2g/100mL瓊脂，滅菌后按每平皿10mL傾倒平板，備用。制備含質(zhì)量濃度0.7g/100mL瓊脂的100mL肉湯培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至 50℃左右，接入0.6mL枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液，混勻后立即取6mL倒入含有瓊脂的平皿上，冷卻后，用打孔器打孔，孔直徑為6 m m。在孔中加入50μL無細胞發(fā)酵上清液，在超凈工作臺上放置3h后，于30℃靜置培養(yǎng)24h，取出平皿后用游標卡尺測量抑菌圈直徑(不含孔徑)。

細菌素效價的測定：根據(jù)Cabo等[7]的方法繪制標準效價曲線，以枯草芽孢桿菌ATCC6633為指示菌，以Nisin為陽性對照。將上述獲得的抑菌圈直徑代入效價回歸方程，計算發(fā)酵液中細菌素的效價。本實驗測得回歸方程為y=0.2425x+0.6111，y表示效價的對數(shù)值；x表示抑菌圈直徑(不含孔徑，單位為mm)，R2=0.9868。

1.3.3 酶水解脫脂乳培養(yǎng)基的制備

配制質(zhì)量濃度4g/100mL的脫脂乳溶液2L，調(diào)pH7.0，水浴中升溫至50℃，添加0.05g/100mL的中性蛋白酶，恒溫水解，水解過程中加入2mol/L的氫氧化鈉維持pH 7.0。根據(jù)pH-stat方法[8]制備成水解度為15%的脫脂乳溶液，然后添加質(zhì)量濃度2g/100mL葡萄糖和0.1g/100mL吐溫-80制成用于發(fā)酵的酶水解脫脂乳培養(yǎng)基。

1.3.4 單因素試驗

按照1.3.3節(jié)方法制備酶水解脫脂乳培養(yǎng)基，裝入3.7L發(fā)酵罐中，裝罐量為2L，115℃滅菌15min。選擇發(fā)酵pH值、發(fā)酵溫度、接種量作為影響抑菌活性的主要因素，通過單因素試驗選取響應(yīng)面試驗的因素和水平。

1.3.4.1 發(fā)酵pH值對植物乳桿菌代謝產(chǎn)細菌素的影響

以1%接種量接種植物乳桿菌KLDS1.0391培養(yǎng)液，發(fā)酵pH值分別設(shè)為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間24h。發(fā)酵結(jié)束后，放罐、取樣，按照1.3.2節(jié)所述方法測定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

1.3.4.2 接種量對植物乳桿菌代謝產(chǎn)細菌素的影響

分別以1%、2%、3%、4%的接種量接種植物乳桿菌KLDS1.0391培養(yǎng)液，發(fā)酵pH值為5.0，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間24h。發(fā)酵結(jié)束后，放罐、取樣，按照1.3.2節(jié)所述方法測定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

1.3.4.3 發(fā)酵溫度對植物乳桿菌代謝產(chǎn)細菌素的影響

以1%接種量接種植物乳桿菌KLDS1.0391培養(yǎng)液，發(fā)酵pH值為5.0，發(fā)酵溫度分別設(shè)為30、35、40℃，發(fā)酵時間24h。發(fā)酵結(jié)束后，放罐、取樣，按照1.3.2節(jié)所述方法測定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌代謝產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取發(fā)酵pH值(X1)、發(fā)酵溫度(X2)和接種量(X3)3個因素為自變量，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值，進行中心組合試驗設(shè)計[9]。每個試驗重復(fù)3次，取其平均值，試驗因素水平及編碼見表1。

表1 試驗因素水平及編碼Table 1 Factors, levels and codes of response surface tests

1.3.6 模型的驗證

通過響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌代謝產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件。在優(yōu)化條件下進行發(fā)酵實驗，通過比較預(yù)測值和實驗值驗證模型的有效性。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

每個試驗重復(fù)3次，取其平均值。采用SAS 8.1及Microsoft Excel 2003統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Design Expert 7.1 軟件進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵pH值對植物乳桿菌KLDS1.0391代謝產(chǎn)細菌素的影響

圖1 發(fā)酵pH值對植物乳桿菌KLDS1.0391代謝產(chǎn)細菌素的影響Fig.1 Effect of fermentation pH on bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391

如圖1所示，發(fā)酵pH值對植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)細菌素的影響顯著(P＜0.05)。當發(fā)酵pH值在4.5～5.0范圍內(nèi)，菌株代謝產(chǎn)生細菌素的抑菌活性迅速增加，當發(fā)酵pH值為5.0時抑菌圈直徑達到最大，隨發(fā)酵pH值繼續(xù)增加，抑菌活性呈逐漸下降趨勢。根據(jù)抑菌圈直徑，選擇發(fā)酵pH5.0為響應(yīng)面試驗中心試驗點。

2.1.2 接種量對植物乳桿菌KLDS1.0391發(fā)酵產(chǎn)細菌素的影響

圖2 接種量對植物乳桿菌KLDS1.0391代謝產(chǎn)細菌素的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391

接種量的大小影響乳桿菌的生長周期，接種量對該菌代謝產(chǎn)細菌素的影響如圖2所示。抑菌活性隨接種量增加而逐漸下降，接種量對該菌產(chǎn)細菌素的影響顯著(P＜0.05)。根據(jù)抑菌圈直徑，選擇接種量為1%進行響應(yīng)面試驗。

2.1.3 發(fā)酵溫度對植物乳桿菌KLDS1.0391代謝產(chǎn)細菌素的影響

圖3 發(fā)酵溫度對植物乳桿菌KLDS1.0391代謝產(chǎn)細菌素的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391

發(fā)酵溫度影響菌體的生長和細菌素的合成。如圖3所示，發(fā)酵溫度為30℃時，抑菌活性最高，抑菌活性隨發(fā)酵溫度的升高呈逐漸下降趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)。根據(jù)抑菌圈直徑，選擇發(fā)酵溫度為30℃進行響應(yīng)面試驗。

2.2 響應(yīng)面模型的建立及其顯著性

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。利用Design Expert7.1軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得的響應(yīng)值抑菌圈直徑(Y)對編碼自變量x1、x2和x3的二次多項式回歸模

對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：模型是顯著的(P＜0.0001)，失擬項不顯著，回歸模型的決定系數(shù)為0.9905，說明該模型能夠解釋99.05%的變化，僅有總變異的0.95%不能用此模型來解釋，該模型擬合程度良好，試驗誤差小，因此，可用此模型對植物乳桿菌KLDS1.0391代謝產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件進行分析和預(yù)測。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis for regression equation

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表Table 4 Significance test for regression coefficients

回歸模型的顯著性分析見表4。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知：模型一次項x1、x3極顯著，x2不顯著；二次項x12極顯著，x22、x32均處于顯著水平；交互項 x2x3顯著，x1x2、x1x3均不顯著。對回歸方程進行中心標準化處理，通過回歸系數(shù)絕對值大小分析各個因素的改變對該植物乳桿菌KLDS1.0391代謝產(chǎn)細菌素的影響程度?；貧w方程一次項的回歸系數(shù)絕對值依次為x1、x3、x2，結(jié)果表明：3個因素對該菌代謝產(chǎn)細菌素的影響大小依次為：發(fā)酵pH值＞接種量＞發(fā)酵溫度。

利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面分別見圖4～6。

圖4 發(fā)酵溫度和pH值對植物乳桿菌KLDS1.0391所產(chǎn)細菌素抑菌活性影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface and contour plot for the effect of cross-interaction between fermentation temperature and pH on antibacterial activity

由圖4可見，兩個因素的交互項不顯著，由響應(yīng)面可以看出，發(fā)酵溫度不變，隨發(fā)酵pH值的增加，抑菌圈直徑先增大，當發(fā)酵pH值超過5.1后，抑菌活性呈逐漸下降的趨勢。發(fā)酵溫度在30～35℃，發(fā)酵pH值在4.8～5.5范圍內(nèi)，抑菌活性較高。乳酸菌在一定pH值條件下合成細菌素，菌體生長的最適pH值與細菌素合成的最適pH值不一定相同。Izquierdo等[10]在對屎腸球菌WHE 81產(chǎn)細菌素的研究中發(fā)現(xiàn)，菌體最適生長pH值為7.0，而細菌素生成的最適pH值為5.0。這與Nel等[11]的研究結(jié)果相符，細菌素一般在弱酸性條件下生成，發(fā)酵pH值低于菌體生長的最適pH值，細菌素產(chǎn)生的最適pH值具有菌株特異性。

圖5 接種量和發(fā)酵pH值對植物乳桿菌KLDS1.0391所產(chǎn)細菌素抑菌活性影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface and contour plot for the effect of crossinteraction between inoculation amount and pH on antibacterial activity

由圖5可見，兩個因素的交互項不顯著，由響應(yīng)面可以看出，發(fā)酵pH值不變，抑菌活性隨接種量的增加而迅速增加，當接種量超過2%時，抑菌活性迅速下降。接種量在1%～2%，發(fā)酵pH值在4.7～5.5范圍內(nèi)，抑菌活性較高。細菌素的產(chǎn)量多在細菌對數(shù)生長后期達到最大值，接種量過大，縮短合成時間，產(chǎn)量有很大程度的下降，細菌素的活性也會降低，這可能也與細菌素吸附到產(chǎn)生菌菌體表面有關(guān)[12]。

圖6 接種量和發(fā)酵溫度對植物乳桿菌KLDS1.0391所產(chǎn)細菌素抑菌活性影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface and contour plot for the effect of crossinteraction between inoculation amount and fermentation temperature on antibacterial activity

由圖6可見，兩個因素的交互項顯著，由響應(yīng)面可以看出，接種量不變，抑菌活性隨發(fā)酵溫度的升高而逐漸增加，當發(fā)酵溫度超過35℃時，抑菌活性迅速下降。發(fā)酵溫度在30～37℃，接種量在1%～2%范圍內(nèi)，抑菌活性較高，抑菌圈直徑可達到14.95mm。菌體生長的最適溫度不一定適合細菌素的生成。相關(guān)研究表明，細菌素在低于菌體最適生長溫度的條件下產(chǎn)量較高，這與細菌素的合成機制有關(guān)，而且不同菌株產(chǎn)細菌素的最適發(fā)酵溫度也不同[13]，擴展短桿菌ATCC9175在28℃時細菌素的產(chǎn)量最高，溫度過高產(chǎn)量下降[14]，腸球菌RZSC5產(chǎn)細菌素的溫度必須控制在35℃，溫度過低或過高細菌素產(chǎn)量明顯減少[15]。

2.3 回歸模型的驗證

通過上述回歸模型，采用 Design-Expert 7.1軟件優(yōu)化發(fā)酵條件，獲得植物乳桿菌KLDS1.0391代謝產(chǎn)細菌素的最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵pH5.1、發(fā)酵溫度33℃、接種量1%，在此條件下抑菌圈直徑可達到15.08mm。采用上述條件進行驗證實驗，結(jié)果獲得的抑菌圈直徑為15.00mm，實驗值與預(yù)測值的相對誤差為0.5%，證明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵條件準確可靠，具有實用價值。未進行發(fā)酵條件優(yōu)化時，細菌素的效價為420.26IU/mL，優(yōu)化后細菌素的效價達到601.32 IU/mL，較優(yōu)化前提高了43.08%。

3 結(jié) 論

3.1 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對植物乳桿菌KLDS1.0391代謝產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，建立了抑菌圈直徑與發(fā)酵pH值、發(fā)酵溫度、接種量3個因素的二次多項式回歸模型，經(jīng)驗證實驗證明該模型合理可靠。

3.23 個因素對該菌代謝產(chǎn)細菌素的影響大小依次為：發(fā)酵pH值＞接種量＞發(fā)酵溫度；最優(yōu)發(fā)酵條件為：pH 5.1、發(fā)酵溫度33℃、接種量1%。在此條件下，發(fā)酵液的抑菌圈為15.00mm，細菌素的效價為601.32IU/mL，較優(yōu)化前提高了43.08%。

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Optimization of Fermentation Conditions of Lactobacillus plantarum for Bacteriocin Production by Response Surface Methodology

CHEN Lin，MENG Xiang-chen*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The fermentation condition of Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 isolated from ,, a traditional fermented cream from Inner Mongolia in China, were optimized for bacteriocin production. Skim milk hydrolyzed by neutral protease was used as the medium; Baicillus subtilis was used as indicator bacteria and diameter of inhibition zone was used as evaluation index of antibacterial activity. Based on the single factor tests, the optimal fermentation conditions for producing antibacterial components with high yield in this strain was explored by response surface methodology with three variables of fermentation pH, fermentation temperature and inoculation amount. Results indicated that the order for affecting the yield of antibacterial components from strong to weak was fermentation pH, inoculation amount and fermentation temperature. The optimal fermentation conditions were pH 5.1, inoculation amount of 1% and fermentation temperature of 33 ℃. Under these optimal conditions, the diameter of inhibition zone reached up to 15.00 mm. The antibacterial activity was increased by 43.08% and reached up to 601.32 IU/mL. Therefore, it is feasible for the established model due to the consistent results between the prediction and experiments.

response surface；bacteriocin；Lactobacillus plantarum；Jiaoke

TQ920.6

A

1002-6630(2011)03-0176-05

2010-04-16

黑龍江省留學(xué)歸國科學(xué)基金項目(LC2009C30)；國家“863”計劃項目(2008AA10Z335)

陳琳(1985—)，女，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：chenlinlucky@163.com

*通信作者：孟祥晨(1970—)，女，教授，博士，主要從事乳品科學(xué)及食品發(fā)酵研究。E-mail：xchmeng@163.com