馮小強(qiáng)，李小芳，楊 聲,2，伏國慶，王廷璞

殼聚糖金屬配合物對(duì)黑曲霉的抑制活性研究

馮小強(qiáng)1，李小芳1，楊 聲1,2，伏國慶3，王廷璞1

(1.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅 天水 741001；2.定西師范高等?？茖W(xué)校化學(xué)系，甘肅 定西 743000；3.天水市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅 天水 741001)

通過觀察黑曲霉菌絲體的生長及孢子萌發(fā)情況，考察殼聚糖(CS)及殼聚糖鋅(CS-Zn)、殼聚糖鎳(CS-Ni)的抗真菌性能。結(jié)果表明：殼聚糖、殼聚糖鋅和殼聚糖鎳對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)和菌絲體生長均具有明顯抑制作用，且殼聚糖金屬配合物的抑菌效果比殼聚糖本身更強(qiáng)，其中殼聚糖鎳最強(qiáng)。殼聚糖鎳對(duì)黑曲霉的抑菌活性受殼聚糖分子質(zhì)量、環(huán)境pH值、質(zhì)量濃度因素的影響較大。分子質(zhì)量為5kD的CS制備的CS-Ni抗真菌效果最好；CS-Ni抑菌效果在pH3～7.5時(shí)隨pH值降低而增強(qiáng)；隨CS-Ni質(zhì)量濃度(0～0.75mg/mL)的增加而增強(qiáng)。

殼聚糖金屬配合物；黑曲霉；抗菌

殼聚糖(chitosan，CS)是甲殼素脫乙酰基后的產(chǎn)物，主要存在于蝦、蟹、蛹及昆蟲等動(dòng)物外殼以及菌類、藻類植物的細(xì)胞壁中。大量的研究證實(shí)，殼聚糖及其衍生物具有廣譜的抗菌性能，可抑制多種細(xì)菌和真菌的生長[1-2]。殼聚糖殘基在C2位上的NH2基，C3位上的—OH是典型的Lewis堿性基團(tuán)，從構(gòu)象上說都是平伏鍵，這種特殊的結(jié)構(gòu)使它們對(duì)具有一定離子半徑的某些金屬離子具有很強(qiáng)的螯合作用。目前，對(duì)于殼聚糖金屬配合物抑菌活性的研究主要集中在對(duì)細(xì)菌的抑制[3-5]，而對(duì)抑制真菌生長的報(bào)道很少。黑曲霉(Aspergillus niger)屬半知菌亞門真菌，能使水分較高的糧食霉變。本實(shí)驗(yàn)擬研究殼聚糖、殼聚糖鋅(CS-Zn)、殼聚糖鎳(CS-Ni)對(duì)黑曲霉生長的影響，旨在為明確殼聚糖及其金屬配合物的抑制真菌機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉(Aspergillus niger)由天水中醫(yī)醫(yī)院提供；殼聚糖(50kD，純度98%) 浙江玉環(huán)縣殼聚糖有限公司；殼聚糖(5、10kD) 濟(jì)南海德貝海洋生物工程有限公司；CS-Ni、CS-Zn制備方法參看文獻(xiàn)[6]，用0.3% HCl溶液溶解。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外光譜儀 日本島津公司；LDZX 40CI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；生化恒溫培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司；SNCJ1BU無菌操作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；JEM-1230透射電子顯微鏡 日本JEOL公司；COIC XSZ-D倒置顯微鏡 重慶光學(xué)儀器廠。

1.3 對(duì)黑曲霉菌絲體徑向生長的影響

將真菌A.niger接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，在27℃活化72h，用已滅菌的打孔器打直徑為0.8cm的菌片備用。3.0mL 分子質(zhì)量為50kD 的CS以及制備的CS-Zn、CS-Ni與一定量PDA混合，使CS、CS-Zn、CS-Ni的最終質(zhì)量濃度均為0.5mg/mL，以3.0mL 0.3%HCl溶液作為空白對(duì)照，滅菌后倒平板，冷卻后在培養(yǎng)皿中央貼一菌片，置于恒溫培養(yǎng)箱27℃培養(yǎng)，觀察A.niger菌絲體生長情況，直到對(duì)照組黑曲霉菌落幾乎長滿培養(yǎng)皿為止。

1.4 對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)的影響

取直徑為0.8cm的黑曲霉菌片，浸入已滅菌的15mL分子質(zhì)量為50kD 的CS以及制備的CS-Zn、CS-Ni溶液中，CS、CS-Zn、CS-Ni的質(zhì)量濃度分別為0.75、0.5、0.25mg/mL?？瞻讓?duì)照為15mL 0.3% HCl溶液，平行3次。在27℃用25W日光燈照射培養(yǎng)12～24h，菌片邊緣的孢子用倒置顯微鏡觀察。以孢子芽管長度超過孢子長徑視為萌發(fā)，按式(1)和(2)計(jì)算CS、CS-Zn和CS-Ni處理的孢子萌發(fā)率和對(duì)孢子萌發(fā)的抑制百分率[7]。

1.5 CS-Ni抑制黑曲霉生長的抑制率

按式(3)計(jì)算CS-Ni抑制黑曲霉生長的抑菌率[8]：

式中：Δ表示培養(yǎng)前后的差值，已經(jīng)對(duì)培養(yǎng)期間水分損失做了補(bǔ)償；Δ對(duì)照培養(yǎng)基質(zhì)量：未加CS-Ni的培養(yǎng)基培養(yǎng)96h前后的質(zhì)量差；ΔCS-Ni培養(yǎng)基質(zhì)量：加CS-Ni的培養(yǎng)基培養(yǎng)96h前后的質(zhì)量差。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖及其金屬配合物對(duì)黑曲霉菌絲體徑向生長的影響

CS、CS-Zn及CS-Ni對(duì)黑曲霉生長的影響如圖1所示。當(dāng)黑曲霉培養(yǎng)5d時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組黑曲霉菌落的徑向生長十分旺盛，菌落幾乎覆蓋了整個(gè)培養(yǎng)皿，有大量呈炭黑色的孢子生長繁殖。在培養(yǎng)基中加入CS或CS-Zn、CS-Ni后，黑曲霉菌落的徑向生長均比對(duì)照組小，且菌片直徑從CS、CS-Zn到CS-Ni逐漸減小，表明CS-Ni對(duì)黑曲霉生長抑制作用最強(qiáng)，CS-Zn次之，C S最弱。

圖1 殼聚糖及其金屬配合物對(duì)黑曲霉生長的影響Fig.1 Effect of CS, CS-Zn and CS-Ni on the growth of A. niger

2.2 對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)的影響

在所選定的質(zhì)量濃度0.25～0.75mg/mL范圍內(nèi)，各質(zhì)量濃度的CS、CS-Zn和CS-Ni對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出一定的抑制作用，并且隨質(zhì)量濃度的增加，對(duì)孢子的抑制效果顯著增大，如圖2所示。CS、CS-Zn和CS-Ni對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)均具有明顯抑制作用，其中CS-Ni效果最顯著。24h后，對(duì)照的孢子萌發(fā)率99.5%；而CS-Ni的處理中，質(zhì)量濃度達(dá)到0.25mg/mL時(shí)，黑曲霉孢子的萌發(fā)率為15%，即對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到85%，0.75mg/mL時(shí)幾乎完全抑制孢子萌發(fā)。

圖2 CS、CS-Zn和CS-Ni對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effect of CS, CS-Zn and CS-Ni on the germination of A. niger spore

李美芹等[7]發(fā)現(xiàn)殼聚糖能抑制番茄葉霉病菌分生孢子萌發(fā)。通過光鏡觀察發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過殼聚糖處理后未萌發(fā)的孢子呈現(xiàn)不同程度的質(zhì)壁分離或畸形等異常現(xiàn)象，熒光素異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記的殼聚糖處理，在熒光顯微鏡下觀察到孢子周圍包被著一層殼聚糖。可見，殼聚糖對(duì)孢子萌發(fā)的影響，一方面可能通過滲透勢的改變而實(shí)現(xiàn)；另一方面，也可能是通過殼聚糖的包被而影響孢子的活力。

從對(duì)黑曲霉菌絲體徑向生長和孢子萌發(fā)的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CS-Ni對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)和菌絲體生長影響效果最強(qiáng)，故以下實(shí)驗(yàn)選擇CS-Ni，考察了殼聚糖分子質(zhì)量、環(huán)境p H值、濃度因素對(duì)其抗真菌活性的影響。

2.3 CS分子質(zhì)量對(duì)CS-Ni抑制黑曲霉生長的影響

圖3 CS分子質(zhì)量對(duì)CS-Ni抑菌性能的影響Fig.3 Antifungal activity of complexes of Ni with CS with different molecular weights

由不同分子質(zhì)量的CS制備的CS-Ni和PDA混合，使CS-Ni的最終質(zhì)量濃度為0.5mg/mL，滅菌后倒平板，在培養(yǎng)皿中央貼一黑曲霉菌片，27℃恒溫培養(yǎng)測量菌絲體的直徑。圖3可以看出，分子質(zhì)量是影響CS-Ni對(duì)黑曲霉抑制作用的重要因素。當(dāng)PDA培養(yǎng)基中加入CS-Ni后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌絲體直徑逐漸增大，但是菌絲體的直徑均比對(duì)照小，CS分子質(zhì)量從5～50kD，對(duì)應(yīng)的菌絲體直徑逐漸增大，表明隨CS分子質(zhì)量的增大，CS-Ni對(duì)抑制黑曲霉菌絲體生長的能力減弱。在本實(shí)驗(yàn)中，分子質(zhì)量為5kD的CS制備的CS-Ni抗真菌活性最強(qiáng)。故以下實(shí)驗(yàn)選用分子質(zhì)量為5kD的CS制備的CS-Ni，考察了環(huán)境pH值、質(zhì)量濃度對(duì)其抗真菌活性的影響以及抗真菌機(jī)理。

2.4 CS-Ni質(zhì)量濃度對(duì)抑制黑曲霉生長的影響

圖4 CS-Ni質(zhì)量濃度對(duì)黑曲霉生長的影響Fig.4 Effect of CS-Ni concentration on the growth of A. niger

如圖4所示，當(dāng)黑曲霉培養(yǎng)5d時(shí)，對(duì)照黑曲霉菌落幾乎長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，而在PDA中加入CS-Ni后，黑曲霉菌絲體的直徑均小于對(duì)照，且隨著CS-Ni質(zhì)量濃度的逐漸增加，黑曲霉菌絲體直徑逐漸減少，當(dāng)CS-Ni的質(zhì)量濃度為0.75mg/mL時(shí)，黑曲霉菌絲幾乎無擴(kuò)充生長，說明CS-Ni對(duì)黑曲霉的最小抑菌質(zhì)量濃度是0.75mg/mL。

2.5 pH值對(duì)CS-Ni抑制黑曲霉生長的影響

培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為3、4.5、5.5、6.5、7.5時(shí)，CS-Ni對(duì)黑曲霉的抑菌率分別為100%、90%、75%、45%、21%，如圖5所示，表明CS-Ni對(duì)黑曲霉的抑菌率隨pH值的增大而減小，當(dāng)pH6.5時(shí)，抑菌率急劇降低。

圖5 pH值對(duì)CS-Ni抑制黑曲霉生長的影響Fig.5 Effect of pH on anti-Aspergillus niger activity of CS-Ni

2.6 CS-Ni處理前后黑曲霉的形貌變化

圖6 CS-Ni對(duì)黑曲霉超微結(jié)構(gòu)的影響(×30000)Fig.6 Effect of CS-Ni on the ultra-structure of Aspergillus niger (×30000)

由圖6a可知，黑曲霉的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁清晰可見，外圍孢子繁殖旺盛。由圖6b可知，殼聚糖分子質(zhì)量為5kD時(shí)，制備的CS-Ni與黑曲霉作用后，發(fā)現(xiàn)黑曲霉孢子生長量比對(duì)照組明顯減少，胞漿內(nèi)容物稀疏，空隙明顯擴(kuò)大，結(jié)構(gòu)分布異常，核內(nèi)出現(xiàn)了異物，可能有一部分CS-Ni進(jìn)入了黑曲霉的內(nèi)部，影響了核仁的正常生理功能。

3 結(jié) 論

CS、CS-Zn、CS-Ni能抑制黑曲霉孢子萌發(fā)及菌絲體生長，且CS-Zn和CS-Ni的抑菌效果比CS本身更強(qiáng)，其中CS-Ni最強(qiáng)。CS-Ni對(duì)黑曲霉的抑菌活性受CS分子質(zhì)量、環(huán)境pH值、質(zhì)量濃度的影響較大。分子質(zhì)量為5kD的CS制備的CS-Ni抗真菌效果最好；CS-Ni抑菌活性隨環(huán)境pH值(pH3～7.5)的降低而增強(qiáng)；隨CS-Ni質(zhì)量濃度(0～0.75mg/mL)的增加而增強(qiáng)。

[1]CHUNG Y C, CHEN C Y. Antibacterial characteristics and activity of acid-soluble chitosan[J]. Bioresource Technol, 2008, 99: 2806-2814.

[2]SEYFARTH F, SCHLIEMANN S, ELSNER P, et al. Antifungal effect of high- and low-molecular-weight chitosan hydrochloride, carboxymethyl chitosan, chitosan oligosaccharide and N-acetyl-D-glucosamine against Candida albicans, Candida krusei and Candida glabrata[J]. Int J Pharm, 2008, 353: 139-148.

[3]WANG Xiaohui, DU Yumin, FAN Lihong, et al. Chitosan-metal complexes as antimicrobial agent: Synthesis, characterization and structure activity study[J]. Polym Bull, 2005, 55: 105-113.

[4]WANG Xiaohui, DU Yumin, LIU Hui. Preparation, characterization and antimicrobial activity of chitosan-Zn complex[J]. Carbohydr Polym, 2004, 56: 21-26.

[5]SANPUI P, MURUGADOSS A, PRASAD P V D, et al. The antibacterial properties of a novel chitosan-Ag-nanoparticle composite[J]. Inter J Food Microb, 2008, 124: 142-146.

[6]李小芳, 馮小強(qiáng), 伏國慶, 等. 殼聚糖鎳配合物吸附尿素性能研究[J].食品工業(yè)科技, 2010, 31(3): 169-171.

[7]李美芹, 肖慧, 孟祥紅, 等. 殼聚糖對(duì)番茄葉霉病菌的抑制作用研究[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 53(2): 244-248.

[8]LI Xiaofang, FENG Xiaoqiang, YANG Sheng, et al. Effects of molecular weight and concentration of chitosan on antifungal activity against Aspergillus niger[J]. Iranian Polymer Journal, 2008, 17(11): 843-852.

Anti-Aspergillus niger Activity of Metal/Chitosan Complexes

FENG Xiao-qiang1，LI Xiao-fang1，YANG Sheng1,2，F(xiàn)U Guo-qing3，WANG Ting-pu1
(1. College of Life Science and Chemistry, Tianshui Normal University, Tianshui 741001, China；2. Department of Chemistry, Dingxi Teachers College, Dingxi 743000, China；3. Traditional Medical Hospital of Tianshui, Tianshui 741001, China)

Chitosan and metal/chitosan complex were evaluated comparatively for their anti-Aspergillus niger activity based on the mycelial growth and spore germination of the fungus. The results showed that both chitosan and metal-chitosan could effectively inhibit the mycelial growth of A. niger and its spore germination, while chitosan displayed lower antifungal activity than its complexes with Zn or Ni, and chitosan/ Ni complex showed the strongest antifungal activity. This biological activity of chitosan was largely influence by its molecular weight and concentration as well as environmental pH. The complex between chitosan with 5 kD molecular weight and Ni had the best inhibitory effect on A. niger. The inhibitory effect of chitosan/Ni complex revealed a change trend opposite to that of pH ranging from 3 to 7.5, but increased with increasing concentration from 0 to 0.75 mg/mL.

metal/chitosan complex；Aspergillus niger；antifungal activity

TQ929.2

A

1002-6630(2011)03-0152-04

2010-05-06

天水師范學(xué)院物理無機(jī)化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(ZD0840)；天水師范學(xué)院中青年教師科研資助項(xiàng)目(TSA1003)

馮小強(qiáng)(1979—)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)樘烊桓叻肿由锘钚浴-mail：fengxiaoq04@lzu.cn