劉萬振，武婷婷，生吉萍，申 琳

有機(jī)和常規(guī)紅提葡萄附生菌的比較分析

劉萬振，武婷婷，生吉萍，申 琳*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

以伊犁金山葡萄莊園的紅提葡萄為原料，通過比較常規(guī)葡萄和有機(jī)葡萄不同器官表面附生菌群的差異，旨在揭示常規(guī)和有機(jī)兩種不同栽培模式對葡萄附生菌群的影響。葡萄附生菌的分離、篩選方法為平板培養(yǎng)法，微生物的計數(shù)方法為最大或然數(shù)法。結(jié)果顯示：葡萄根部附生菌的群落總數(shù)最大(105CFU/mm2)，莖次之，果實(shí)最小(約102CFU/mm2)。在果實(shí)上，有機(jī)葡萄附生真菌種類多于常規(guī)葡萄，而附生細(xì)菌種類與之相反。除葡萄葉沒有顯著差異外，有機(jī)葡萄各器官(根、莖、果實(shí))附生菌菌落總數(shù)均大于常規(guī)葡萄。初步表明，有機(jī)栽培可以更好地保持生態(tài)環(huán)境中微生物群落的生物多樣性。

紅提葡萄；有機(jī)食品；附生菌；食品安全

紅提葡萄又名紅地球葡萄，原產(chǎn)于美國，是美國加利福尼亞州立大學(xué)研究人員通過雜交實(shí)驗培育而成的一個葡萄品種。自1986年引入該品種以來[1]，紅提葡萄的種植在我國北方得到了大力推廣。新疆伊犁地區(qū)深居內(nèi)陸，受高山阻隔，海洋濕氣很難進(jìn)入，年平均降雨量較少。由于日照時間較長(年日照時間可達(dá)3000h左右)，葡萄光合作用積累的有機(jī)物多；較大的晝夜溫差(9月份可高達(dá)17℃)又降低了葡萄夜間的呼吸作用強(qiáng)度，減少了有機(jī)物的消耗。所以在近乎天然的廣袤的新疆大地上種植葡萄，無論在產(chǎn)量還是在質(zhì)量上，都走在了全國前列[2]。

隨著人們生活水平的提高，公眾倡導(dǎo)的“天然、營養(yǎng)、健康”的消費(fèi)理念正在推動著食品工業(yè)朝著綠色、有機(jī)食品的方向快速發(fā)展。目前國內(nèi)葡萄以常規(guī)葡萄栽培為主，有機(jī)葡萄栽培悄然興起。與常規(guī)栽培模式相比，有機(jī)栽培模式下的葡萄管理成本升高、單產(chǎn)降低，其單價高出常規(guī)葡萄數(shù)倍之多，但是由于沒有農(nóng)藥殘留，有機(jī)葡萄深受廣大消費(fèi)者，尤其是高收入群體的青睞。

植物附生菌(epiphyte)是一類附著在植物表面、以植物分泌物為營養(yǎng)的微生物類群。植物附生菌菌群復(fù)雜多樣，在植物抗病、生長等過程中起著重要的作用。因生長在植物的表面，植物附生菌菌群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量易受地勢、空氣溫度、濕度、空氣流動、陽光等因素影響[3]；施肥、噴灑農(nóng)藥，也能影響附生菌的群落結(jié)構(gòu)。

作為一種漿果類水果，葡萄在貯運(yùn)過程中容易擠壓擦傷，進(jìn)而滋生腐敗微生物，導(dǎo)致大面積腐爛。常見的葡萄病害包括白腐病、灰霉、霜霉病、白粉病等[4]。抑制采后葡萄病原菌生長、延長葡萄貯藏期一直是一個難點(diǎn)問題。以有機(jī)和常規(guī)紅提葡萄為實(shí)驗材料，研究葡萄各器官附生菌之間的關(guān)系、尤其是常規(guī)和有機(jī)葡萄之間附生菌在數(shù)量上的差異，探討葡萄采后病害問題，可為采后葡萄貯藏保鮮提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

常規(guī)和有機(jī)紅提葡萄根、莖、葉、果實(shí)，均采自新疆伊犁霍城縣金山葡萄莊園(兩實(shí)驗材料選自同一地理環(huán)境，可排除自然環(huán)境的影響)。

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂(N)(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂粉15～20g、蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(P)(馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉15～20g、蒸餾水1000mL，自然pH值)；酵母菌培養(yǎng)基(Y)(葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏5g、瓊脂粉20g、蒸餾水1000mL，自然pH值)；高氏1號培養(yǎng)基(F)(可溶性淀粉20g、KNO31g、NaCl 0.5g、K2HPO4·3H2O 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、瓊脂粉15～20g、蒸餾水1000mL，pH7.4～7.6)，以上培養(yǎng)基均在121℃濕熱滅菌20min后使用[5]。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-50KB高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；YT-CJ-2DN潔凈工作臺 北京亞泰科隆實(shí)驗科技開發(fā)中心；VORTEX-5混勻器 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SHP-450生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗儀器有限公司；DW-86L386立式超低溫保存箱 青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 采樣方法

為防止樣品水分蒸發(fā)，早晨9點(diǎn)左右開始采樣。

葡萄果實(shí)：手戴一次性無菌手套，選取果穗均勻、無病蟲害和機(jī)械傷的果穗，小心剪下，并迅速裝進(jìn)無菌采樣袋，4℃保存。

葡萄莖、葉：手戴一次性無菌手套，隨機(jī)選取無病蟲害的莖、葉，小心剪下后迅速裝進(jìn)無菌采樣袋，4℃保存。

葡萄根：手戴一次性無菌手套，剪取不同年齡段的根，迅速裝進(jìn)無菌采樣袋，4℃保存。

1.4.2 葡萄器官附生菌的計數(shù)方法

隨機(jī)挑取規(guī)則的葡萄器官(葡萄果實(shí)以球體為模型、根和莖以圓柱體為模型、葉剪成長方形)，每種器官取3份，分別測量其表面積；然后將其放入盛有75mL無菌水的三角瓶中，用封口膜扎好；將三角瓶移至170r/min的搖床中振搖1h；迅速將葡萄器官轉(zhuǎn)移至另一個盛有無菌水的三角瓶中，重復(fù)振搖3次，3次振搖后的菌液分別按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次梯度稀釋，并分別平板涂布，重復(fù)3次；然后置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，按照最大或然數(shù)(must probable number，MPN)法計數(shù)。附生菌總數(shù)以前三次振搖后之和計。

1.4.3 葡萄器官附生菌種類計數(shù)方法

根據(jù)菌落形態(tài)差異，分別挑取各葡萄器官附生菌，并進(jìn)行純化，然后分別統(tǒng)計從不同器官分離的菌落形態(tài)不同的附生菌的種類。

1.4.4 統(tǒng)計學(xué)分析方法

用Origin 8.0軟件對所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和鄧肯檢驗，選取的顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 在不同培養(yǎng)基上有機(jī)和常規(guī)葡萄葉附生菌菌落總數(shù)比較

圖1 有機(jī)和常規(guī)葡萄葉附生菌菌落總數(shù)比較Fig.1 Comparison of leaf epiphyte number between organic and common grapes

由圖1可知，P培養(yǎng)基培養(yǎng)時，有機(jī)葡萄葉的菌落總數(shù)為120CFU/mm2，有機(jī)葡萄葉附生真菌菌落總數(shù)是常規(guī)葡萄葉的1.89倍，差異顯著(P＜0.05)。N培養(yǎng)基培養(yǎng)時，有機(jī)葡萄葉的菌落總數(shù)為947CFU/mm2，是常規(guī)葡萄葉的1.25倍，差異顯著(P＜0.05)。在Y和F培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，常規(guī)葡萄葉和有機(jī)葡萄葉附生菌的菌落總數(shù)差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 在不同培養(yǎng)基上有機(jī)和常規(guī)葡萄果實(shí)附生菌菌落總數(shù)比較

圖2 有機(jī)和常規(guī)葡萄果實(shí)附生菌菌落總數(shù)比較Fig.2 Comparison of fruit epiphyte number between organic and common grapes

由圖2可知，在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)，有機(jī)葡萄果實(shí)附生菌菌落總數(shù)和常規(guī)葡萄果實(shí)附生菌差異顯著(P＜0.05)。P培養(yǎng)基培養(yǎng)時，有機(jī)葡萄果實(shí)附生菌的菌落總數(shù)為34CFU/mm2，是常規(guī)葡萄果實(shí)的1.97倍。N培養(yǎng)基培養(yǎng)時，有機(jī)葡萄果實(shí)的菌落總數(shù)為532CFU/mm2，是常規(guī)葡萄的1.60倍。F培養(yǎng)基培養(yǎng)時，有機(jī)葡萄果實(shí)的菌落總數(shù)為351CFU/mm2，是常規(guī)葡萄果實(shí)的2.60倍。在Y培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，有機(jī)葡萄果實(shí)為54CFU/mm2，是常規(guī)葡萄的2.87倍。有機(jī)葡萄果實(shí)附生菌菌落總數(shù)顯著大于常規(guī)葡萄。

2.3 不同葡萄器官的附生菌菌落總數(shù)比較

表1 不同器官附生菌菌落總數(shù)比較Table 1 Comparison of epiphyte number on different organs of organic and common grapes

由表1可知，有機(jī)和常規(guī)葡萄相比，除葡萄葉外，葡萄根、莖、果實(shí)的附生菌菌落總數(shù)差異顯著(P＜0.05)，有機(jī)葡萄的根、莖、果實(shí)附生菌菌落總數(shù)均大于常規(guī)葡萄，其中根部差異最大，有機(jī)葡萄根部附生菌為常規(guī)葡萄的6.73倍。葡萄果實(shí)和葡萄葉附生菌菌落總數(shù)較少，推測附生菌的菌落總數(shù)可能與器官表面的粗糙程度有關(guān)。器官越粗糙，比表面積越大，微生物越容易黏附和滋生。而葡萄根附生菌菌落總數(shù)是其他器官的數(shù)十倍，分析可能是根圍微生物大量黏附在根表面的原因。噴灑農(nóng)藥和施用化肥，會影響微生物的正常生命活動[3-5]，這也是造成有機(jī)葡萄器官附生菌數(shù)量大于常規(guī)葡萄的重要原因。

圖3 不同葡萄器官附生細(xì)菌種類比較Fig.3 Comparison of epiphyte bacterial species on different organs of organic and common grapes

圖4 葡萄器官附生真菌種類Fig.4 Comparison of the numbers of epiphyte fungi species on different organs of organic and common grapes

圖5 有機(jī)葡萄和常規(guī)葡萄附生菌種類比較Fig.5 Comparisons of the number of epiphyte fungi and bacterial species on different organs of organic and common grapes

由圖3可知，有機(jī)葡萄莖和葡萄根附生細(xì)菌的種類少于常規(guī)葡萄，而有機(jī)葡萄果實(shí)和葡萄葉附生細(xì)菌種類多于常規(guī)葡萄。圖4說明，有機(jī)葡萄果實(shí)和葡萄根附生真菌的種類多于常規(guī)葡萄。圖3、4顯示，常規(guī)葡萄莖附生細(xì)菌種類最多，達(dá)15種，常規(guī)葡萄根次之，為14種，常規(guī)葡萄果實(shí)最少，僅為5種；在有機(jī)葡萄器官中，附生細(xì)菌的種類由葡萄根、葡萄莖、葡萄葉和葡萄果實(shí)呈遞減趨勢。與之相反，附生真菌種類最多的是有機(jī)葡萄果實(shí)，其在常規(guī)葡萄果實(shí)表面的種類為6種，在葡萄莖和根部較少。由此推測，附生菌種類除與器官粗糙程度有關(guān)外，也可能與器官表面的微環(huán)境有關(guān)。附生菌在植物器官表面營寄生生活，而各器官表面不盡相同的分泌物，對微生物起到一定的選擇和富集作用，進(jìn)而影響附生微生物的種群分布[3]。圖5表明，有機(jī)葡萄附生真菌種類多于常規(guī)葡萄，而細(xì)菌種類比常規(guī)葡萄少。

3 討 論

植物的根、莖、葉、果實(shí)等表面，黏附著大量的細(xì)菌[6]、真菌[7]、古菌等附生菌[3]，這些附生菌可以通過水平基因轉(zhuǎn)移[8]、和植物互惠共生[9-10]、轉(zhuǎn)變成內(nèi)生菌、轉(zhuǎn)變成植物病原菌或者成為植物腐生菌等方式與植物相互作用[3]。

葡萄樣品采自于伊犁霍城縣金山葡萄莊園，由于處于同一環(huán)境，排除了氣候等外界條件的干擾。有機(jī)葡萄器官附生菌群落總數(shù)大于常規(guī)葡萄，附生真菌種類較多，細(xì)菌種類略少于常規(guī)葡萄，微生物種類與微生物群落總數(shù)之間無相關(guān)關(guān)系。Granado等[9]研究金冠蘋果在有機(jī)農(nóng)業(yè)體系(organic farming system)和復(fù)合農(nóng)業(yè)體系(integrated farming system)下附生菌之間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，有機(jī)蘋果附生真菌包括22個類群，高于非有機(jī)模式下的真菌類群數(shù)。此外，葡萄的栽培方式可能影響器官附生菌群的變化，施肥和噴灑農(nóng)藥對微生物種群結(jié)構(gòu)及數(shù)量影響較大[3,9]。

附生菌通過產(chǎn)生胞外分泌物，在器官表面形成一種生物膜，黏合在植物器官表面。附生菌的這種生存方式，既可以防止菌體水分過多蒸發(fā)[3]，又增強(qiáng)了其對農(nóng)藥的抵抗能力[11]。無論有機(jī)葡萄還是常規(guī)葡萄，葡萄果實(shí)附生菌的群落總數(shù)都最小，葡萄根表面的微生物群落總數(shù)最多，根部的附生菌遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他器官。附生細(xì)菌種類最少的葡萄果實(shí)，真菌種類卻最多，說明微生物種類可能與器官表面的微環(huán)境和器官的外滲物質(zhì)類型有關(guān)[8]。

張學(xué)君[12]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果附生菌中存在著多種對蘋果常見病癥——輪紋病和炭疽病起拮抗作用的微生物。有機(jī)栽培的蘋果表面附生的絲狀真菌的類群和數(shù)量均比非有機(jī)栽培的蘋果豐富，推測可能與栽培模式有關(guān)，豐富的附生真菌可能會抑制蘋果病原菌，利于病害的防治[9]。附生菌可以通過營養(yǎng)競爭、占位效應(yīng)、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等方式抑制表面病原菌的繁殖，而常規(guī)栽培模式中的噴灑農(nóng)藥和施用化肥等，會改變附生菌原始的群落組成，打破其群落平衡，在采摘之后，這種群落的不平衡可能會導(dǎo)致果實(shí)的過早腐爛。

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Comparative Analysis of Epiphyte between Organic and Common Red Globe Grapes

LIU Wan-zhen，WU Ting-ting，SHENG Ji-ping，SHEN Lin*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Both organic and conventional red globe grape were sampled from Jinshan vineyard in Yili. The effect of different farming models of conventional and organic farming models on the epiphyte distribution was studied preliminarily in current paper by comparing the epiphytic biodiversity in grape organs. The agar-plate culture method was used for the microbial isolation, and the most-probable-number (MPN) was used for the enumeration of epiphyte population. The result was as follows: the largest number of epiphytes located on the root (up to 105CFU/mm2), and the stem took second place, and the smallest on fruit (about 102CFU/mm2). Besides, the amount of epiphytic fungi species of the organic grape was slightly higher than that of conventional grape; on the contrary, the amount of epiphytic bacteria species of the organic grape was lower. The number of epiphytic microorganisms of organic grape was more than that of conventional grape on all organs except leaf. The organic farming was shown to be more effective to keep the biodiversity of microbial communities in ecological environment.

red globe grape；organic food；epiphyte；food safety

TS201.3

A

1002-6630(2011)03-0126-04

2008-08-08

國家自然科學(xué)基金項目(30972065；30671471)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科技項目(200803033)；

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD22B07-01；2007BAC15B05-04；2008BADAIB07)

劉萬振(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：liuwanzhen123@163.com

*通信作者：申琳(1964—)，男，教授，博士，研究方向為農(nóng)副產(chǎn)品綜合利用。E-mail：shen5000@gmail.com