李 欣，薛治浦，朱文學

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

丹參不同部位總酚酸和總黃酮含量分析及其抗氧化活性研究

李 欣，薛治浦，朱文學

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

以丹參根、莖、葉為研究對象，在測定其總酚酸及總黃酮含量的基礎上，以VC為陽性對照，選用還原力、DPPH自由基清除率和多不飽和脂肪酸(PUFA)過氧化體系對不同部位醇提物進行抗氧化活性評價。結果表明：葉中總酚酸和總黃酮含量顯著高于其他部位，其總酚酸含量分別為根和莖的1.07倍和6.81倍；總黃酮含量分別為根和莖的4.79倍和14.5倍。在預設質量濃度為20mg/mL時，丹參葉醇提物的抗氧化活性最強，其還原力、DPPH自由基清除率、對PUFA過氧化體系的抑制作用分別相當于VC(1mg/mL)的1.08、1.01、5.78倍?？偡铀岬暮亢涂寡趸钚灾g具有很高的相關性，表明抗氧化活性可能與酚酸類物質有關。

丹參；總酚酸；總黃酮；抗氧化活性

唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)通常以根部入藥，是治療心腦血管疾病的傳統(tǒng)中藥材，具有活血化瘀、通絡止痛、清熱安神的功效[1]，主產于山西、河北、河南、四川、江蘇、安徽等地。丹參根部主要含有兩大類活性成分，其中水溶性的酚酸類成分(丹酚酸、迷迭香酸、原兒茶酸、咖啡酸、丹參素等)具有很強的抗脂質過氧化和清除自由基作用[2-3]。

由于合成抗氧化劑對健康的潛在危害，近年來，從天然植物中尋找天然的抗氧化劑引起人們極大的興趣。以往的研究表明，傳統(tǒng)的中藥材尤其是唇形科植物具有很強的抗氧化活性，并且目前已知的抗氧化物質多屬于酚酸類成分。丹參是我國傳統(tǒng)醫(yī)學中應用最早而且最廣泛的藥物之一，每年的產量約在5000～7000t，其地上部分占全草的三分之二，卻被當雜質棄去。國內外學者們對丹參根的強抗氧化活性進行了大量研究，但丹參其他部位的抗氧化活性及活性成分未見報道。研究表明，丹參地上部分不含有丹參酮類脂溶性有效成分，含有和根部相似的酚酸類有效成分[4]。本實驗對丹參不同部位總酚酸、總黃酮的含量進行測定，并采用3種常用的體外抗氧化活性評價方法，對丹參不同部位乙醇提取物的抗氧化活性進行比較研究，以期為丹參進一步綜合應用于醫(yī)藥和開發(fā)新型保健品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丹參于2009年10月采自河南孟縣藥材基地，經河南科技大學食品與生物工程學院朱文學教授鑒定為Salvia miltiorrhiza Bunge。將各部位樣品(根、莖、葉)仔細分揀，自然晾干后，粉碎，過40目篩，冷藏備用。

蘆丁和沒食子酸對照品 中國藥品生物制品檢定所；福林試劑 上海荔達生物科技有限公司；1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 美國Sigma公司；抗壞血酸(分析純)、無水乙醇(分析純)。

1.2 儀器與設備

722N型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；FA1004精密電子天平 上海上平儀器公司；HH-S6數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；KQ-500DE型數控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LXJ-ⅡB型離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備[5]

各稱取干燥至恒質量的丹參根、莖、葉各1g，以80%的乙醇溶液為溶劑，各加入30mL，置于50mL錐形瓶中，混勻，放入超聲清洗器中超聲提取30min冷卻至室溫，過濾取濾液，濾渣進行二次超聲振蕩提取，合并濾液，定容至50mL(相當20mg鮮樣/mL)，密閉冷藏保存，備用。取樣品液1 m L，作為試樣待測。

1.3.2 總黃酮、總酚酸含量的測定

總黃酮含量的測定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[6]，標準曲線為y=7.728x+0.0185(R2=0.9989)，其中：x為吸光度，y為提取液中總黃酮含量(mg/mL)，檢測波長510nm，以蘆丁來計算。

總酚酸含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[7]，標準曲線為：y=0.007x+0.027(R2=0.9982)，其中：x為總酚含量(μg/mL)，y為吸光度，檢測波長為765nm，以沒食子酸來計算。

1.3.3 抗氧化活性的測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH溶液的配制：準確稱取7.88mg DPPH用無水乙醇溶解，定容于100mL容量瓶中，搖勻，配制為濃度2×10-4mol/L的溶液，保存于冰箱中，備用。

通常的抗氧劑樣品溶液在實驗條件下均幾乎無色，對DPPH的測量不形成干擾，一般采用Larrauri等[8]和Yokozawa等[9]的方法進行研究。但植物提取物中化學成分復雜，可能干擾吸光度的測定。因此，本實驗參考楊懷霞等[10]和郭亞力等[11]的方法并進行改進，采用該法研究提取物的抗氧化活性可排除干擾。

向2.5mLDPPH的乙醇溶液中加入1mL樣品，混合均勻，30min 后用分光光度計在517nm波長處測定吸光度Ai，同時測定2.5mL DPPH 的乙醇溶液與 1.0mL 80%乙醇溶液混合液的吸光度AC及2.5mL乙醇與1.0mL樣品混合液的吸光度Ab，清除率按公式(1)計算：

1.3.3.2 還原能力測定

實驗采用高鐵鹽-鐵氰化鉀比色法[12]測定樣品的還原能力。

反應體系為： lmL樣品溶液，2.5mL磷酸緩沖溶液(0.2mol/L；pH6.6)，2.5mL K3Fe(CN)6溶液(質量分數1%)，混勻，50℃下保溫20min，隨后加入2.5mL三氯乙酸溶液(質量分數10%)，混合后4℃離心10min(3000r/min)，取上清液2.5mL，加入2.5mL去離子水和0.5mL FeCl3溶液(質量分數0.1%)，充分混合后，靜置10min，于700nm波長處測定吸光度。陽性對照為VC。

1.3.3.3 PUFA過氧化體系中抗氧化活性(AOA)的測定

采用以Fe2+誘發(fā)卵黃磷脂C2位上的極低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)過不飽和脂肪酸(PUFA)的過氧化模型，用硫代巴比妥酸法測定樣品的抗脂質過氧化作用，參照文獻[13]的方法，略有改進。

卵黃懸液：新鮮雞蛋去清，卵黃用等體積的pH 7.45，0.lmol/L 磷酸鈉緩沖液(PBS)配成1:1懸液，磁力攪拌10min，再用PBS緩沖液稀釋成1:25的懸液(置于冰箱中備用)。

測定方法：在具塞試管中加入0.4mL卵黃懸液，0.1mL不同濃度樣品溶液，0.4mL FeSO4(25mmol/L)，3.1mLPBS(0.1mol/L；pH 7.45)，混勻于37℃恒溫振蕩15min，取出后加入lmL 三氯乙酸(質量分數20%)，3500r/min離心10min，吸取2mL上清液加入lmL TBA(質量分數0.8%)，加塞放入沸水浴中15min，冷卻后，以空白管(3mL蒸餾水代替)調零，于532nm波長處比色測定吸光度，不加樣品管(以0.1mLPBS緩沖液代替樣品)的吸光度為A，樣品管的吸光度為A樣。樣品AOA用卵黃脂蛋白脂質過氧化(LPO)的抑制率表示。

式中：AOA為樣液在卵黃脂蛋白脂質過氧化體系中的過氧化抑制率；A樣為加入樣液反應后的吸光度平均值；A為空白組的吸光度平均值。

1.3.4 統(tǒng)計方法

每個實驗重復3次，結果以x±s表示。數據結果采用DPS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 丹參不同部位總酚酸和總黃酮含量

丹參根、葉、莖各部位均含有總酚酸、總黃酮成分，但含量存在一定差異。本實驗采用分光光度法測定不同部位的總酚酸、總黃酮的含量，結果見表1。

表1 丹參不同部位有效成分含量Table 1 Yields of bioactive components from different parts of Salvia miltiorrhiza Bunge

由表1可知，丹參各部位總酚、總黃酮含量葉中最高，分別為(60.82±0.84)、(15.59±0.08)mg/g，而這兩類成分在莖中含量最低，分別為(8.92±1.31)、(1.07± 0.12)mg/g。葉中總酚酸和總黃酮含量顯著高于根和莖部的含量，其總酚酸含量分別為根和莖的1.07倍和6.81倍，總黃酮含量分別為根和莖的4.79倍和14.5倍。

2.2 丹參不同部位的抗氧化能力

表2 丹參不同部位和VC抗氧化能力比較Table 2 Comparison of antioxidant activities between extracts from different parts of Salvia miltiorrhiza Bunge and vitamin C

由表2可知，丹參不同部位乙醇提取液在預設的質量濃度20mg/mL時的抗氧化活性存在差異。

2.2.1 各部位的總還原力

抗氧化劑的抗氧化能力與其還原力有關，還原力越大，抗氧化能力越強。抗氧化劑能夠在一定的條件下將Fe3+還原為Fe2+，因此，根據Fe3+還原為Fe2+的多少來間接可以評價各種提取物的抗氧化能力[14]。由表2可知，丹參各部位還原力存在一定差異，總酚酸含量高的還原力也相對較強，其中，總酚酸含量最高的葉提取物的還原力最強，顯著高于根、莖和VC(P＜0.05)，為VC(1mg/mL)的108.4%，根的還原力為VC的97.3%，總酚酸含量最低的莖的還原力最弱，僅為VC的26.3%。還原力大小順序為葉＞VC＞根＞莖。

2.2.2 丹參各部位對DPPH自由基的清除作用

由表2可知，丹參葉醇提物對DPPH自由基的清除能力最強，為VC(1mg/mL)的101.1%，顯著高于根、莖和VC；丹參根的醇提物清除DPPH自由基的能力和VC差異不顯著(P＞0.05)；丹參莖醇提物清除DPPH自由基的能力最弱，顯著低于VC(P＜0.05)，為VC的57.1%；丹參各部位醇提物對DPPH自由基的清除率的大小順序為葉＞VC＞根＞莖，丹參各部位醇提物的清除能力與總酚酸含量和還原能力成正相關。

2.2.3 對PUFA過氧化體系的抑制作用

吸光度越小，表示對PUFA過氧化體系的抑制作用越強[15]。由表2可知，丹參各部位對Fe2+誘發(fā)的卵黃脂蛋白PUFA過氧化體系有明顯的抑制作用，其中酚酸含量相對高的根和葉，其抑制作用也較強，分別為(83.07±2.35)%、(81.49±1.65)%，莖的抑制作用最弱。丹參各部位對PUFA過氧化體系的抑制作用顯著高于VC(P＜0.05)，其作用大小順序為：根＞葉＞莖＞VC。和VC(1mg/mL)相比，根、葉、莖的抑制作用分別相當于VC的5.89、5.78、2.41倍。

2.3 丹參不同部位有效成分含量與抗氧化活性相關性分析

表3 2種有效成分含量與抗氧化活性相關性分析Table 3 Correlation analysis of the contents of two bioactive components and antioxidant activities

由表3可以看出，丹參不同部位總酚酸的含量與其抗氧化活性之間有顯著線性相關性，相關系數在P＜0.01水平上均大于0.9，說明抗氧化活性與總酚酸含量呈顯著的正相關，總酚酸含量越高的樣品，其抗氧化能力越強；丹參不同部位抗氧化活性和總黃酮的相關系數均小于0.55(P＜0.05)，說明總黃酮的含量與抗氧化活性之間相關性稍差。因此酚酸類物質為其抗氧化活性的重要貢獻者。

3 結 論

在3個不同的抗氧化活性評價模型中，丹參根、莖、葉3個部位呈現出了不同的抗氧化活性。其中，丹參葉的醇提物抗氧化活性最強，其還原力、DPPH自由基清除率顯著高于根和莖、對PUFA過氧化體系的抑制作用顯著高于莖，在預設質量濃度(20mg/mL)下，高于 VC(1mg/mL)；總酚酸物質和總黃酮含量也顯著高于其他部位，可作為天然抗氧化劑的來源。

通過對總酚酸、總黃酮與抗氧化活性的相關性分析，其抗氧化活性和總酚酸含量之間存在顯著線性相關性，與黃酮類物質含量之間的相關性較差，表明酚酸類成分為其抗氧化活性的重要成分。

目前國內外對丹參葉的研究很少，對化學成分和相關活性的研究也僅停留在成分預試和有效成分含量測定方面。為了更好的開發(fā)、利用這一植物資源，對丹參葉中抗氧化酚類物質的提取、分離及各成分間的協(xié)同作用和活性有待進一步深入研究。

[1]林琦, 陸金國. 丹參抗動脈粥樣硬化的研究進展[J]. 山西中醫(yī), 2002, 18(4): 56-58.

[2]PETER M, SIMMONDS M S. Rosmarinic acid[J]. Phytochemistry, 2003, 62(2): 121-125.

[3]黃詒森, 張均田. 丹參中3種水溶性成分的體外抗氧化作用[J]. 藥學學報, 1992, 27(2): 96-100.

[4]王新勝, 吳艷芳, 趙瑞娜. 丹參地上部分活性成分TLC分析[J]. 海峽藥學, 2007, 19(12): 46-47.

[5]趙愛云, 胡博路, 杭瑚, 等. 部分植物抗氧化活性的初步研究[J]. 天然產物研究與開發(fā), 2000, 12(3): 42-44.

[6]DEWANTO V, WU X, ADOM K K, et al. Thermal processing enhances the nutritional value of tomatoes by increasing total antioxidant activity [J]. J Agric Food Chem, 2002, 50(10): 3010-3014.

[7]SINGLETON V L, ROSSI J A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1965, 16(3): 144-158.

[8]LARRAURI J A, SANCHEZ MORENO C, SAURA-CALIXTO F. Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomace peels[J]. Agric Food Chem, 1998, 46 (7): 2694-2697.

[9]YOKOZAWA T, DONG E, NATAGAWA T. in vitro and in vivo Studies on the radical scavenging activity of tea[J]. Agric Food Chem, 1998, 46(6): 2143-2150.

[10]楊懷霞, 馬慶一, 許閩. 葡萄籽原花青素的梯度分離及其抗氧化活性研究[J]. 河南中醫(yī)學院學報, 2004,19(5): 14-16.

[11]郭亞力, 李聰, 歐靈澄, 等. 3種分光光度法對天然抗氧化物質抗自由基性能的分析檢測[J]. 分析試驗室, 2004, 23(10): 43-48.

[12]OYAIZU M. Studies on products of browning reactions: Antioxidative activity of products of browning reaction prepared from glucosamine[J]. Japanese Journal of Nutrition, 1986, 44: 307-315.

[13]張爾賢, 方黎, 張捷. 菊花提取物抗氧化活性的研究[J]. 食品科學, 2000, 21(7): 6-8.

[14]CHOI Y, JEONG H S, LEE J. Antioxidant activity of methanolic extracts from some grains consumed in Korea[J]. Food Chemistry, 2007, 103(1): 130-138.

[15]王會, 郭立, 謝文磊. 抗氧化劑抗氧化活性的測定方法(一)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(3): 92-98.

Antioxidant Activities and Contents of Total Flavonoids and Phenols from Different Parts of Salvia miltiorrhiza Bunge

LI Xin，XUE Zhi-pu，ZHU Wen-xue
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

The contents of total phenols and total flavonoids from different parts of Salvia miltiorrhiza Bunge were determined. Antioxidant activities of the extracts from root, leaves and stem of Salvia miltiorrhiza Bunge were evaluated by reducing power on Fe3+, scavenging capability on DPPH free radicals and inhibitory effect on PUFA using vitamin C as the reference. Results indicated that the contents of total phenolic acids and total flavonoids from leaves were significantly higher than those in root and stem. Total phenols in leaves were 1.07 folds and 6.81 folds higher than that of root and stem, respectively. Total flavonoids in leaves were 4.79 folds and 14.5 folds higher than that of root and stem, respectively. Antioxidant activities of ethanol extract from leaves were significantly higher than those of root and stem. The reducing power, scavenging capability on DPPH free radicals and inhibitory effect on PUFA of extracts from Salvia miltiorrhiza were 1.08-, 1.01- folds and 5.78-folds higher than those of vitamin C. A positive correlation was observed between the content of total phenols and antioxidant activities, which demonstrated that the antioxidant activity was related to the content of total phenols.

Salvia miltiorrhiza Bunge；total flavonoids；total phenols；antioxidant activity

Q946.82

A

1002-6630(2011)03-0108-04

2010-06-09

河南科技大學科研創(chuàng)新能力培育基金項目(2009CZ0015)

李欣(1979—)，女，副教授，博士，研究方向為天然產物活性。E-mail：lixinpxy@hotmail.com