周笑犁，印遇龍,3，阮 征,*

大豆寡糖體外發(fā)酵特性研究

周笑犁1,2，印遇龍1,2,3，阮 征1,2,*

(1. 南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2. 南昌大學生命科學與食品工程學院， 江西 南昌330031；3. 中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所， 湖南 長沙 410125)

采用體外發(fā)酵技術評價大豆寡糖對豬腸道食糜體外發(fā)酵特性和發(fā)酵產物的影響，探討其作為功能食品或飼料添加劑的作用機制。選用正常的環(huán)江香豬，處死后無菌取空腸、回腸、盲腸和結腸食糜作為接種物，分別以5種質量濃度的大豆寡糖(50、100、200、500、800mg/L)和葡萄糖為底物進行體外發(fā)酵。記錄產氣量，48h后檢測發(fā)酵液pH值、NH3-N、乙酸、丙酸和丁酸的含量。結果表明：接種回腸食糜的大豆寡糖組最大理論產氣量和產氣速率顯著高于培養(yǎng)液對照組(P＜0.05)，顯著低于葡萄糖組(P＜0.05)。接種結腸和盲腸食糜的寡糖組和葡萄糖組的體外發(fā)酵延滯產氣時間顯著低于對照組，200mg/L大豆寡糖的發(fā)酵動力學參數最優(yōu)；200mg/L寡糖組發(fā)酵液pH值和NH3-N含量顯著低于培養(yǎng)液對照組(P＜0.05)；接種各腸段食糜的寡糖組和葡萄糖組發(fā)酵產丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸含量均顯著高于對照組(P＜0.05)，200mg/L大豆寡糖接種結腸食糜產丁酸含量最高。食品中添加大豆寡糖有利于被腸道微生物利用產生SCFA。

大豆寡糖；發(fā)酵特性；短鏈脂肪酸

抗生素的使用為提高動物生產水平、改善人類膳食結構做出了重大貢獻，但是抗生素長期使用帶來肉奶制品安全與生態(tài)環(huán)境等問題。為了研究和開發(fā)抗生素的替代品，人們發(fā)現一些寡糖能選擇性地刺激腸道有益菌的生長繁殖而不能被大部分有害菌利用。近年來，國內外研究表明寡糖具有類似抗生素的作用，可取代抗生素而添加于動物飼料中。大豆寡糖(s o y b e a n oligosaccharides，SBOS)是大豆中或其他豆科作物種子中所含有的可溶性糖類的總稱，它是α-半乳糖苷類，主要由水蘇糖、棉子糖和蔗糖組成。一種低甜度、低熱量的甜味劑，能替代蔗糖應用在功能性食品或低能量食品中。具有改善腸道菌群平衡，防治便秘；抑制腸道有害物質的產生；降低血清膽固醇和血脂的濃度；增強機體免疫能力，抑制腫瘤細胞生長；促進腸道內營養(yǎng)物質的生成與吸收和保護肝臟的作用等[1-5]。大豆寡糖在大腸中發(fā)酵或部分發(fā)酵，產生短鏈脂肪酸(short chain fat acids，SCFA)，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸和一些相應的支鏈脂肪酸，其中乙酸、丙酸及丁酸占80%以上[6-7]。SCFA對腸道健康具有重要意義，表現為：可以促進結腸細胞的代謝、生長、分化；為腸黏膜上皮細胞及肌肉、腎、心、腦提供能量，影響肝脂質與碳水化合物的調控等；可降低大腸中的p H值，抑制致病菌的生長、繁殖，減少結腸癌發(fā)病率[8]。本實驗利用體外發(fā)酵模型研究不同含量的大豆寡糖對生長仔豬各腸段微生物發(fā)酵功能的影響，以期篩選出適宜的添加量，并為大豆寡糖在食品或動物添加劑中進一步應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 添加劑

大豆寡糖( SBOS，含量大于85%)購自南通四海植物精華有限公司。

1.2 培養(yǎng)液配制

參考Barry等[9]的方法，微量培養(yǎng)液(g/L)：NaHCO3(9.240)、Na2HPO3·12H2O(7.125)、NaC1(0.470)、KC1 (0.450)、Na2SO4(0.100)、CaC12(0.055)、MgC12(0.047)、尿素(0.400)，加蒸餾水定容至1000mL，混勻。 痕量緩沖液(mg/L)：FeSO4·7H2O 3680、MnSO4·7H2O 1900、ZnSO4·7H2O 440、CoC12·6H2O 120、CuSO4·5H2O 98、Mo7(NH4)6O2·4H2O 17.4，加蒸餾水定容至1000mL，混勻。使用前在1L微量培養(yǎng)液中加入10mL痕量緩液，混勻備用。

1.3 體外發(fā)酵實驗

1.3.1 體外實驗設計

采用體外法進行，第一批為寡糖梯度：大豆寡糖添加水平設6個，分別為0(對照組)、50、100、200、500、800mg/L和200mg/L葡萄糖組，每個處理4個重復，接種物為回腸食糜。確定最適寡糖質量濃度后，接種物再選用不同腸段食糜，分別為空腸、回腸、結腸和盲腸，每個處理3個重復。

1.3.2 批次培養(yǎng)操作

選用2只體質量為25kg 左右的香豬，放血處死后，采集各腸段內容物，立即放入事先充有CO2的無菌保溫瓶內，混勻。稀釋食糜前，37℃水浴條件下向培養(yǎng)液中連續(xù)沖入CO230min，將pH值調整至6.9～7.0。將采集的腸道食糜與培養(yǎng)液混勻(1:10，m/V)，分裝在用于發(fā)酵實驗的100mL注射器內，并在每10mL混合液中加入待測樣品或200mg葡萄糖。樣品處理不得超過30min，最后將注射器放到搖床上37℃，水浴振蕩培養(yǎng)48h[10-12]。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 發(fā)酵動力學參數

記錄接種后0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、30、36h和48h時的產氣量。根據產氣量統(tǒng)計達到最大產氣速率的時間(h)、最大產氣速率(mL/h)和最大產氣量(mL/g，以干基計)。采用Schofield等[13]提出的方程描述產氣動力學特性。

GP = A exp {-exp [1 + b e / A ( Lag -t)]}

式中：GP表示t時刻累積產氣量/mL；A表示最大理論產氣量/mL；b表示產氣速率/(mL/h)，Lag表示體外發(fā)酵產氣延滯時間/h；t表示發(fā)酵時間點，e為自然對數函數的底數，約為2.71828。

通過Nlreg軟件確定A、b、Lag 3個發(fā)酵參數，其中A和b值越大、Lag越小，表示該發(fā)酵底物具有良好的發(fā)酵特性，是一種理想的碳源。

1.4.2 發(fā)酵終產物測定

發(fā)酵結束時，將發(fā)酵液1000r/min離心10min得上清液，立即置于冰上用Delta 320型pH計(Mettler公司)測定發(fā)酵上清液的pH值。用UV-160A紫外分光光度計(日本島津)在550nm波長處測定上清液中NH3-N的含量[14-15]。將發(fā)酵液按體積比4:1在上清液中加入25%偏磷酸溶液，用HP 5890 Series Ⅱ型氣相色譜儀測定乙酸、丙酸和丁酸的含量[11]。

1.5 數據統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵動力學參數

表1 接種回腸食糜不同質量濃度大豆寡糖的發(fā)酵動力學參數(n=4)Table 1 Fermentation kinetic parameters in the ileum group supplemented with SBOS at various concentrations (n=4)

由表1可見，不同質量濃度大豆寡糖的最大理論產氣量均顯著低于葡萄糖組(P＜0.05)，顯著高于培養(yǎng)液對照組； 50mg/L大豆寡糖最大理論產氣量最小，其他組間差異不顯著。各質量濃度大豆寡糖的產氣速率均顯著低于葡萄糖組(P＜0.05)，顯著高于培養(yǎng)液對照組，其中以質量濃度為200mg/L時最高；不同質量濃度的發(fā)酵延滯時間與培養(yǎng)液組相比也有顯著差異(P＜0.05)，質量濃度為100mg/L時較長。通過不同質量濃度大豆寡糖發(fā)酵動力學參數，200mg/L時最大理論產氣量和產氣速率較大，而發(fā)酵延滯時間較小，該質量濃度的大豆寡糖具有良好的發(fā)酵特性，是一種理想的碳源。

表2 大豆寡糖對不同腸段的發(fā)酵動力學參數(n=3)Table 2 Fermentation kinetic parameters in various parts of intestinal supplemented with SBOS (n=3)

由表2可見，不同腸段大豆寡糖的最大理論產氣量與葡萄糖組無顯著差異，顯著高于培養(yǎng)液對照組(P＜0.05)。各腸段寡糖組的產氣速率顯著高于培養(yǎng)液組；在空腸和盲腸中大豆寡糖的產氣速率與葡萄糖組無顯著差異，回腸中大豆寡糖組的產氣速率顯著低于葡萄糖組，結腸中寡糖組產氣速率的顯著高于葡萄糖組(P＜0.05)?？漳c、回腸中大豆寡糖組和葡萄糖組的發(fā)酵延滯時間顯著高于培養(yǎng)液對照組，而在盲腸和結腸則顯著低于培養(yǎng)液對照組，對微生物來講表示理想碳源。大豆寡糖組在空腸的發(fā)酵延滯時間顯著低于葡萄糖組，在其他各腸段兩組無顯著差異。

2.2 發(fā)酵液的pH值和NH3-N含量

表3 接種回腸食糜不同質量濃度大豆寡糖發(fā)酵液的pH值和NH3-N含量(n=4)Table 3 pH and NH3-N content in fermentation broth of ileum group supplemented with SBOS at various concentrations (n=4)

由表3可見，不同質量濃度大豆寡糖發(fā)酵后，其發(fā)酵液的pH值和NH3-N含量存在一定的差異，與培養(yǎng)液對照組的pH值相比，寡糖組和葡萄糖組的顯著降低(P＜0.05)，寡糖組隨著質量濃度的增加，pH值呈逐漸下降趨勢，200mg/L SBOS的pH值顯著低于50mg/L和100mg/L SBOS的pH值，顯著高于500mg/L、800mg/L SBOS和葡萄糖組的pH值。隨著SBOS質量濃度的增加，其N H3-N含量先呈下降趨勢然后升高，200mg/L SBOS的NH3-N含量相對其他質量濃度的大豆寡糖較低，葡萄糖組的pH值與NH3-N含量均最低。揭示大豆寡糖有最適攝入量，過高的質量濃度產生較高的NH3-N。

表4 大豆寡糖對不同腸段發(fā)酵液的pH值和NH3-N含量(n=3)Table 4 pH and NH3-N content in fermentation broth of various parts of intestinal supplemented with SBOS (n=3)

由表4可見，大豆寡糖在不同腸段發(fā)酵后，其發(fā)酵液的pH值和NH3-N含量存在一定的差異，各腸段寡糖組和葡萄糖組的pH值顯著低于培養(yǎng)液對照組(P＜0.05)，不同腸段的SBOS組和葡萄糖組pH值沒有顯著差異；各腸段寡糖組和葡萄糖組的NH3-N含量顯著低于培養(yǎng)液對照組(P＜0.05)，空腸、回腸的葡萄糖組NH3-N含量顯著低于SBOS組(P＜0.05)，結腸和盲腸的SBOS組和葡萄糖組NH3-N含量差異不顯著。

2.3 發(fā)酵液中SCFA含量

表5 不同質量濃度大豆寡糖對回腸發(fā)酵液短鏈脂肪酸含量及比例(n=4)Table 5 Content and proportion of short-chain fatty acids infermentation broth of ileum group supplemented with SBOS at various concentrations (n=4)

由表5可見，SBOS組和葡萄糖組乙酸、丙酸和丁酸含量均高于培養(yǎng)液對照組，乙酸含量隨著SBOS質量濃度的增加呈先減少再增加的趨勢，當200mg/LSBOS達到最小時和葡萄糖組的乙酸含量沒有顯著差異；丙酸、丁酸隨著SBOS質量濃度的增加呈先增加再減少的趨勢，當SBOS在200mg/L時，乙酸含量最低，丁酸含量最高。各處理中乙酸和丙酸所占比例均較高，丁酸含量則較低。

表6 大豆寡糖對不同腸段發(fā)酵液短鏈脂肪酸含量及比例(n=3)Table 6 Content and proportion of short-chain fat acids in fermentation broth from different parts of intestinal supplemented with SBOS (n=3)

由表6可見，大豆寡糖與在不同腸段食糜混合發(fā)酵后，其發(fā)酵液的SCFA含量存在一定的差異?；啬c中各組乙酸含量差異不顯著外，其余各腸段SBOS組和葡萄糖組SCFA含量都顯著高于培養(yǎng)液對照組(P＜0.05)。不同腸段SBOS組和葡萄糖組乙酸含量沒有顯著差異?？漳c組和回腸腸段SBOS組丁酸含量與葡萄糖組有顯著差異，而在盲腸和結腸差異不顯著；在結腸SBOS組產生的丁酸量最高。

3 討 論

本實驗結果表明：在體外條件下，適宜質量濃度的SBOS降低了培養(yǎng)液中pH值和NH3-N含量，增加了培養(yǎng)液中的SCFA，尤其是增加了丙酸和丁酸的含量。

由于動物實驗費時、費力且成本較高，用食糜為接種物進行體外發(fā)酵是預測發(fā)酵底物營養(yǎng)價值的一種簡捷、經濟的方法[16]。一般認為，發(fā)酵過程中產氣量的多少、各種氣體的比例及產氣速率與底物的化學結構和微生物種類存在一定的關系[17]。當以豬各腸段食糜為接種物進行發(fā)酵時各質量濃度寡糖組的最大理論產氣量均顯著高于培養(yǎng)液對照組，卻顯著低于葡萄糖組，說明豬腸道微生物可以利用SBOS進行發(fā)酵，但產酸和產氣的多少因底物及其濃度不同而異。各處理前24h產氣量占總產氣量的90%左右，隨著寡糖含量的提高，產氣量和發(fā)酵動力學參數先逐步提高再減少，在200mg/L時達到最大；而對照組24h后才發(fā)酵，由此可見，寡糖組和葡萄糖組產氣量主要來自于碳水化合物，200mg/L大豆寡糖發(fā)酵參數最優(yōu)，說明該質量濃度寡糖是一種良好的碳源。

功能性寡糖能選擇性地刺激腸道有益菌的生長繁殖，特別是被盲腸和結腸微生物代謝利用，而不能被大部分有害菌利用，經發(fā)酵或部分發(fā)酵后產生SCFA，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、延胡索酸和一些相應的支鏈脂肪酸，以乙酸、丙酸及丁酸為主[7,18-19]。

SCFA中乙酸是膽固醇合成的最主要的底物，在機體內，大部分乙酸經門靜脈進入肝臟的代謝[20]；乙酸可以被許多組織攝取和利用，是機體從小腸不能消化吸收的碳水化合物中得到能量的主要途徑[8]。丙酸經結腸吸收以后由肝臟代謝作為能源，并可以抑制肝膽固醇和脂肪的合成，提高高密度脂蛋白膽固醇和甘油三脂[21]。丁酸被認為是結腸細胞所需的最重要的能量來源，有助于結腸細胞的分化及增殖等[21-23]。不同的代謝底物和質量濃度決定了微生物區(qū)系的細菌種類和腸道SCFA的數量與種類[24]。從不同質量濃度的SBOS對回腸食糜體外發(fā)酵實驗可知，較高質量濃度的寡糖可能不能被腸道微生物充分降解利用或者改變了腸道微生物區(qū)系，導致SCFA含量下降。在接種物為豬各腸段食糜、底物為大豆寡糖的實驗中，結果表明了在發(fā)酵液中乙酸的含量較大，但添加SBOS后，在腸道中分解主要產生的是丙酸和丁酸，因此可以有效阻斷肝臟膽固醇和脂肪合成，降低血清脂質水平。而且結腸比回腸產生的SCFA要多，這可能與結腸微生物數量多，導致結腸比回腸的發(fā)酵更徹底。丁酸含量在寡糖質量濃度200mg/L時最高，并在結腸中含量也最高，說明不同接種物和底物對體外發(fā)酵的影響是相當明顯的。一般認為SCFA產量提高和NH3-N含量降低對動物健康有利，同時發(fā)酵產生的酸性物質可降低腸道pH值。本研究結果表明，SBOS發(fā)酵后SCFA產量增加，pH值和NH3-N含量降低，這與發(fā)酵特性一致。綜上所述，碳源不同的發(fā)酵底物影響SCFA類型和數量，且由于不同的SCFA有各自特定的生理作用，可能會導致不同的代謝結果。200mg/L大豆寡糖有很好的發(fā)酵效果，其發(fā)酵參數、SCFA產量、降低pH值和NH3-N含量均顯著優(yōu)于其他各寡糖質量濃度。

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Fermentation Characteristics of Soybean Oligosaccharides in vitro

ZHOU Xiao-li1,2，YIN Yu-long1,2,3，RUAN Zheng1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031,China；3. Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China)

in vitro fermentation technology was used to evaluate the effects of soybean oligosaccharides (SBOS) on fermentation kinetic parameters and fermentation products, which also used to explore its action mechanisms as food or feed additives. Sterile jejunum, ileum, cecum or colon chyme as the inoculum were collected from Huanjiang normal pigs to conduct in vitro fermentation using SBOS at the concentrations of 50, 100, 200, 500 mg/L and 800 mg/L, and glucose as the substrates. The gas production, pH, and the contents of NH3-N, acetic acid, propanoic acid and butyric acid in the fermentation broth were determined after 48 h fermentation in an anaerobic system. Results indicated that the maximum amount and rate of gas production in the fermentation broth of ileum group supplemented with SBOS were higher than those of the control group (P＜0.05), while an obvious lag in gas-producing time was observed in fermentation broth of colon or cecal group supplemented with SBOS and glucose. Compared with the control group, the lower gas-producing amount and rate was observed in fermentation broth of colon or cecum group supplemented with SBOS and glucose (P＜0.05). The fermentation kinetic parameters at the condition of 200 mg/L SBOS were the best. The pH and NH3-N content in fermentation broth of colon or cecum group supplemented with 200 mg/L SBOS were lower (P＜0.05) when compared with the control group, but higher (P＜0.05) when compared with the ileum group supplemented with glucose. The proportion of short chain fatty acids (SCFA) in the groups supplemented with SBOS and glucose was higher than that of the control group (P＜0.05). The content of acetic acid was decreased due to the addition of SBOS, while the contents of propionate acid and butyrate acid exhibited a gradual increase. The maximum content of butyrate acid was observed in the fermentation broth of colon group supplemented with 200 mg/L SBOS. Therefore, SBOS is beneficial to gut health as functional food or feed additives to modulate SCFA production patterns in intestinal microflora. Its optimal level is 200 mg/L.

soybean oligosaccharides；fermentation characteristics；short chain fatty acids (SCFA)

TS218；R151.3

A

1002-6630(2011)03-0098-05

2010-05-05

南昌大學“贛江學者獎勵計劃”項目；中國博士后科學基金資助項目(20080440166；200902537)

周笑犁(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為碳水化合物營養(yǎng)調控。E-mail：lizi008009@126.com

*通信作者：阮征(1978—)，男，副教授，博士，研究方向為碳水化合物及其營養(yǎng)調控。E-mail：ezruan@yahoo.com